靶向小胶质细胞的miR-30b复合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种靶向小胶质细胞的miR-30b复合物，由K9肽（KKKKKKKKK）和S9肽（VVMKFLTQQ）的融合肽与miR-30b通过静电作用结合而成，该复合物可利用S9肽的导向作用，特异靶向小胶质细胞表面特异性CX3CR1受体，在S9肽与CX3CR1受体作用的同时，miR-30b高效转染入小胶质细胞，抑制小胶质细胞的活化，进而抑制由小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病的发生或恶化，可用于制备治疗由小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病的药物，在神经系统疾病治疗领域有着良好的开发应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域，涉及一种多肽-基因复合物，还涉及该复合物的制备方法和在制药领域中的应用。
技术介绍
小胶质细胞作为中枢神经系统免疫防疫的第一道防线，在炎症反应中起重要作用。当有外来病原体入侵或有细胞死亡，小胶质细胞会迅速被激活并将其清除，同时释放炎症因子介导炎症反应。但有研究表明，过度活化的小胶质细胞可能加速某些中枢神经系统疾病的进程，而其释放的细胞毒性因子也会对神经细胞造成进一步的损伤。因此，适当抑制小胶质细胞的活性可能是治疗中枢神经系统疾病的有效途径。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类约21-25个核苷酸的非编码RNA分子，普遍存 在于真核生物中，不编码蛋白质或多肽，而是与靶基因的信使RNA (mRNA) 3’非翻译区互补结合，导致靶基因mRNA的降解或翻译抑制，从而实现转录后基因调控作用。近年来，miRNA与神经系统疾病的发病关系越来越受重视。miRNA已被证实参与了神经细胞的发育与分化、细胞活化及应答调控等过程，并且与神经系统有关疾病的发生发展密切相关。例如，在缺血缺氧引发的小胶质细胞介导的炎症反应中，小胶质细胞特定miRNA会发生表达改变，调控宿主细胞的基因表达，应对微环境做出相应的反应，从而参与疾病的发生与发展。因此，miRNA在小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病的治疗领域可能具有极为广阔的应用前景。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种miR_30b复合物，该复合物可以特异靶向小胶质细胞，抑制小胶质细胞的活化，进而抑制由小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病的发生或恶化。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案1.靶向小胶质细胞的miR-30b复合物，由K9肽和S9肽的融合肽与miR_30b通过静电作用结合而成，所述K9肽的氨基酸序列为KKKKKKKKK(Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys_Lys-Lys),所述 S9 妝的氨基酸序列为 VVMKFLTQQ(Val-Val-Met-Lys-Phe-Leu-Thr-Gln-Gln)。进一步，所述K9肽和S9肽的融合肽由K9肽的羧基端和S9肽的氨基端直接连接。2.靶向小胶质细胞的miR_30b复合物的制备方法，是在涡旋条件下，向含有miR-30b和氯化钠的水溶液中滴加K9肽和S9肽的融合肽溶液，滴毕，继续涡旋2(Γ60分钟，再静置2(Γ60分钟，即得靶向小胶质细胞的miR-30b复合物。进一步，所述miR_30b与K9肽和S9肽的融合肽的质量比为2. 5:1。进一步，所述靶向小胶质细胞的miR_30b复合物的制备方法是在涡旋条件下，向含有浓度为500 μ g/mL的miR-30b和浓度为lmg/mL的氯化钠的水溶液中，滴加等体积浓度为200 μ g/mL的K9肽和S9肽的融合肽溶液，滴加完毕后，继续涡旋30分钟，再静置30分钟，即得靶向小胶质细胞的miR-30b复合物。3.靶向小胶质细胞的miR_30b复合物在制备治疗由小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病的药物中的应用。本专利技术的有益效果在于K9肽为带正电荷的短肽，可通过电性中和作用与带负电荷的miRNA聚合形成致密颗粒，提高细胞对miRNA的摄取率，增强转染效率。CX3CR1受体在中枢神经系统中主要在小胶质细胞上表达，来源于US28受体N末端的诱惑配体多肽S9可以阻断人源CX3CR1受体结合生理性趋化因子形成的趋化作用，但其本身不引起趋化运动，不影响胞内信号转导和细胞自然活性。本专利技术所述miR-30b复合物可通过S9肽的导向作用，特异靶向小胶质细胞表面特异性CX3CR1受体，在S9肽与CX3CR1受体作用的同时，miR-30b高效转染入小胶质细胞，抑制小胶质细胞的活化，进而抑制由小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病的发生或恶化，可用于制备治疗由小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病的 药物，在神经系统疾病治疗领域有着良好的开发应用前景。附图说明图1为透射电镜鉴定miR_30b复合物。图2为miR_30b复合物转染的小胶质细胞活化后细胞因子的分泌水平。图3为miR_30b复合物转染的小胶质细胞对少突胶质细胞的杀伤水平。具体实施例方式为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。一、靶向小胶质细胞的miR_30b复合物的制备1、K9肽和S9肽的融合肽K9-S9的制备 融合肽K9-S9由K9肽的羧基端与S9肽的氨基端直接连接而成，氨基酸序列为KKKKKK-KKKVVMKFLTQQ (SEQ ID No.1)。融合肽K9-S9的合成在AB-431A型多肽合成仪上进行，采用标准Fmoc方案。以O.25mmol对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯(HMP)树脂为起始树脂，按照融合肽K9-S9的氨基酸序列，使肽链自羧基端向氨基端逐个延伸，肽链合成完毕后，将含有肽链的树脂转移至切割液(由酒石酸乙二胺O. 25mL、三氟乙酸9. 5mL和去离子水O. 25mL组成)中，室温下搅拌反应使肽链从树脂上裂解下来，然后用G6玻砂漏斗过滤，收集滤液，室温下低压蒸干，残余物用去离子水溶解后，用Akta explorer 100型中压液相色谱仪进行纯化，色谱柱为C18柱，流动相A为质量分数为O. 1%的三氟乙酸水溶液，流动相B为质量分数为O. 1%的三氟乙酸乙腈溶液，二元线性梯度洗脱，流动相B的体积分数在(Γ15分钟内由10%上升至50%，流速为lmL/min,收集融合肽K9-S9的洗脱液，冷冻干燥，即得融合肽K9-S9，用去离子水溶解制成浓度为3mg/mL的溶液，用孔径为O. 20 μ m的微孔滤膜过滤除菌，_70°C冻存备用。取融合肽K9-S9的洗脱液，用Delta 600型反相高压液相色谱仪进行纯度鉴定，色谱柱为Symmetry C18柱，流动相A为质量分数为O. 1%的三氟乙酸水溶液，流动相B为质量分数为O. 1%的三氟乙酸乙腈溶液，二元线性梯度洗脱，流动相B的体积分数在(Γ15分钟内由10%上升至60%，流速为lmL/min。结果经峰面积归一化法计算，融合肽K9-S9的纯度为98%。另取融合肽K9-S9的洗脱液，用API 2000 LC/MS/MS型质谱仪进行分子量鉴定，结果显示，融合肽K9-S9的分子量实测值与理论值相符。2、miR_30b复合物的制备 miR-30b 的核苷酸序列为5’ -AUGUAGACCUU⑶GAUUAG-3’ (SEQ ID No. 2)。于室温、涡旋条件下，向100 μ L含有浓 度为500 μ g/mL的miR_30b和浓度为lmg/mL的NaCl的水溶液中，滴加100 μ L浓度为200 μ g/mL的融合肽K9-S9溶液，滴加速度为5 μ L/min,滴加完毕后，于室温下继续涡旋30分钟，再静置30分钟，即得miR-30b复合物。将新鲜制备的miR-30b复合物滴于200目铜网上，吸附3分钟，用吸水纸吸干，晾干30秒，以质量分数为1%的醋酸铀水溶液负染30秒，用吸水纸吸干，晾干30秒，SOkV透射电镜观察。结果如本文档来自技高网...

【技术保护点】
靶向小胶质细胞的miR?30b复合物，其特征在于，由K9肽和S9肽的融合肽与miR?30b通过静电作用结合而成，所述K9肽的氨基酸序列为KKKKKKKKK，所述S9肽的氨基酸序列为VVMKFLTQQ。

【技术特征摘要】
1.靶向小胶质细胞的miR-30b复合物，其特征在于，由K9肽和S9肽的融合肽与 miR-30b通过静电作用结合而成，所述K9肽的氨基酸序列为KKKKKKKKK，所述S9肽的氨基酸序列为VVMKFLTQQ。2.根据权利要求1所述的靶向小胶质细胞的miR-30b复合物，其特征在于，所述K9肽和S9肽的融合肽由K9肽的羧基端和S9肽的氨基端直接连接而成。3.权利要求1或2所述的靶向小胶质细胞的miR-30b复合物的制备方法，其特征在于， 在涡旋条件下，向含有miR-30b和氯化钠的水溶液中滴加K9肽和S9肽的融合肽溶液，滴毕，继续涡旋2(Γ60分钟，再静置2(Γ60分钟，即得靶向小胶质细胞的miR-30b复合物...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨曌，杨清武，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：