改进的抗-血清白蛋白结合变体制造技术

本发明专利技术涉及抗-血清白蛋白免疫球蛋白单可变结构域DOM7h-11的改进的变体，以及包含这种变体的配体和药物缀合物、组合物、核酸、载体和宿主。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改进的抗-血清白蛋白结合变体本专利技术涉及抗-血清白蛋白免疫球蛋白单一可变结构域D0M7h-ll的改进的变体， 以及包含这种变体的配体和药物缀合物、组合物、核酸、载体和宿主。专利技术背景W004003019和W02008/096158公开了具有治疗有用的半衰期的抗_血清白蛋白(SA) 结合部分，如抗-SA免疫球蛋白单一可变结构域(dAbs)。这些文献公开了单体抗-SA dAbs 以及包含这种dAbs的多特异性配体，例如，包括抗-SA dAb和特异性结合目标抗原如TNFRl 的dAb的配体。公开了特异性结合来自多于一个物种的血清白蛋白的结合部分，例如人/ 小鼠交叉反应的抗-SA dAbs。W005118642和W02006/059106公开了为了增加药物的半衰期而将抗-SA结合部分，如抗-SA免疫球蛋白单一可变结构域，缀合或结合至药物的概念。其公开并例举了蛋白、肽和新的化学实体(NCE)药物。W02006/059106公开了使用这种概念以增加促胰岛素释放试剂(insulintropic agents),例如,肠降血糖素激素如胰高血糖素样肽(GLP)-1的半衰期。还可参考Holt攀，“Ant1-Serum albumin domain antibodies for extending the half-lives of short lived drugs，，，Protein Engineering, Design & Selection, vol 21，no 5，pp283-288, 2008。W02008/096158 公开了一种很好的抗-SA dAb，D0M7h_ll。 期望提供作为D0M7h-ll的变体并特异性结合血清白蛋白，优选来自人和非人物种的白蛋白的改进的dAbs，这将在疾病的动物模型中以及对于人的治疗和/或诊断提供实用性。还期望在相对温和和高亲和力的抗-SA结合部分(dAbs)之间提供选择。这种部分可以连接至药物，根据设想的最终应用选择抗-SA结合部分。根据抗-SA结合部分的选择，这允许更好地定制药物以治疗和/或预防慢性或急性适应症。还期望提供是单体或者在溶液中基本上如此的抗-SA dAbs。以拮抗受体为目的，当抗-SA dAb被连接到特异性结合细胞表面受体如TNFRl的结合部分例如dAb时，这是特别有利的。抗-SA dAb的单体状态在减少受体交联的机会中是有用的，因为可以结合并交联细胞表面上的受体(例如，TNFR1)的多聚体形成的可能性更小，从而增加了受体激动和有害的受体信号传递的可能性。PCT/EP2010/052008 和 PCT/EP2010/052007 公开了许多改进的 dAbs，其公开内容被引用并入。还期望提供具有改进稳定性的改进的dAbs。这对于允许dAb具有合适的稳定性特征或储存时间是有利的。具体而言，期望提供具有暴露于升高的温度后耐受解折叠 (unfolding)的改进的能力，即改进的热稳定性，的dAbs。还期望提供当形式为构建体如多特异性配体或者当缀合于蛋白、肽或NCE时具有改进的稳定性的dAbs。专利技术概述本专利技术的方面解决了这些问题。为了这个目的，本专利技术人惊讶地发现，可以对D0M7h_ll系的免疫球蛋白单一可变结构域分子进行突变，得到由相对于母体D0M7h-ll分子的改进的热稳定性所测定的分子的改进的稳定性。在一个方面中，提供了 D0M7h-ll(D0M7h-ll如附图说明图1中所示)的抗-血清白蛋白(SA)免疫球蛋白单一可变结构域变体，所述变体具有至少54°C的1 。在另一个方面中，提供了 D0M7h-ll(D0M7h-ll如图1中所示)的抗-血清白蛋白(SA)免疫球蛋白单一可变结构域变体，所述变体具有高于54°C的Tm。转化中点(Tm)为其中50%蛋白是在其天然构象并且其它50%是变性的温度。合适地，通过差示扫描量热法测定所述Tm。在一个实施方案中，与D0M7h_ll相比，所述变体在22、42或91位(根据Kabat 编号)中任何位置包含至少一个突变。合适地，抗-SA免疫球蛋白单一可变结构域变体是 D0M7h-ll-15(D0M7h-ll-15 如图 1(SEQ ID NO 7)中所示)的变体，与 D0M7h_ll_15 相比， 在22、42或91位(根据Kabat编号)中任何位置包含至少一个突变。在一个实施方案中， 变体包含选自下列的至少一个突变22 位=Ser、Phe、Thr、Ala 或 Cys ;42 位=Glu 或 Asp ；91 位=Thr 或 Ser ；在其它实施方案中，提供了抗-SA免疫球蛋白单一可变结构域变体，其中22位是Ser 或Phe ;抗-SA免疫球蛋白单一可变结构域变体，其中42位是Glu和91位是Thr ;抗-SA免疫球蛋白单一可变结构域变体，其中91位是Thr ;抗-3么免疫球蛋白单一可变结构域变体， 其中22位是Phe。在一个实施方案中，108位是Trp。进一步的实施方案提供了变体，所述变体包含与选自D0M7h-ll-56 (SEQ ID NO: 412)、D0M7h-l 1-68 (SEQ ID NO :416)、D0M7h_l 1-79 (SEQ ID NO :418)和 D0M7h-ll_80 (SEQ ID NO 419)的单一可变结构域的氨基酸序列相同的氨基酸序列(或者所述变体具有与选择的氨基酸序列的氨基酸序列至少95、96、97、98或99%相同的氨基酸)或者与选择的氨基酸序列相比具有最多达4个改变的氨基酸序列。尤其地，已经发现，针对D0M7h-ll的FW3 (57-88位，根据Kabat编号)和CDR3区 (89-97位，根据Kabat编号)的突变赋予改进的稳定性。因此，在另一个实施方案中，提供了与本专利技术的一个方面一致的抗-SA免疫球蛋白单一可变结构域变体，其中，与D0M7h-ll 相比，所述变体在FW3区中(57-88位，根据Kabat编号)或在CDR3区中(89-97位，根据 Kabat编号)包含至少一个突变。进一步的实施方案提供了抗-SA免疫球蛋白单一可变结构域，其中所述变体是 D0M7h-l 1-15 (D0M7h-l 1-15如图1中所示)的变体，与D0M7h_ll_15相比，所述变体在FW3 区中(57-88位，根据Kabat编号)或在CDR3区中(89-97位，根据Kabat编号)包含至少一个突变。合适地，所述变体在77、83、93或95位(根据Kabat编号)中任何位置包含至少一个突变。在一个实施方案中，变体包含选自下列的至少一个突变77 位=Asn、Gln83 位=Val、lie、Met、Leu、Phe、Ala 或正亮氨酸。93 位=Val、lie、Met、Leu、Phe、Ala 或正亮氨酸。95 位=His、Asn、Gin、Lys 或 Arg。 在另一个实施方案中，本专利技术的抗-SA免疫球蛋白单一可变结构域在106或108 位(根据Kabat编号)还包括突变。合适地，106位是Asn或Gin。合适地，108位是Trp、 Tyr 或 Phe。在进一步的实施方案中，提供了抗-SA免疫球蛋白单一可变结构域变体，其中77 位是Asn ;抗-SA单一可变结构域，其中83位是Val ;抗-SA单一可本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.05.20 US 61/346,5191.D0M7h-ll(D0M7h-ll如图1(SEQ ID NO:438)中所示)的抗-血清白蛋白(SA)免疫球蛋白单一可变结构域变体，所述变体具有至少54°C的Tm。2.权利要求1要求保护的抗-SA免疫球蛋白，其中所述变体与D0M7h-ll相比在22、42或91位(根据Kabat编号)中任何位置包含至少一个突变。3.权利要求2要求保护的抗-SA免疫球蛋白单一可变结构域变体，其中所述变体是D0M7h-l 1-15 (D0M7h-l 1-15 如图1 (SEQ ID NO 2)中所示)的变体，与 D0M7h_ll_15 相比在22,42或91位(根据Kabat编号)中任何位置包含至少一个突变。4.权利要求1-3中任一项的变体，其中所述变体包含选自下列的至少一个突变22 位=Ser、Phe、Thr、Ala 或 Cys ;42 位=Glu 或 Asp ；91 位=Thr 或 Ser。5.权利要求4要求保护的抗-SA免疫球蛋白单一可变结构域变体，其中22位是Ser或Phe06.权利要求4要求保护的抗-SA免疫球蛋白单一可变结构域变体，其中42位是Glu，91位是Thr。7.权利要求4要求保护的抗-SA免疫球蛋白单一可变结构域变体，其中91位是Thr。8.权利要求4要求保护的抗-SA免疫球蛋白单一可变结构域变体，其中22位是Phe。9.权利要求1或2的变体，其中所述变体包含与选自D0M7h-l1-56 (SEQ ID N0:412)、D0M7h-ll-68 (SEQ ID N0:416)、D0M7h_ll_79 (SEQ ID N0:418)和 D0M7h-ll_80 (SEQ IDN0:419)的单一可变结构域的氨基酸序列相同或者与所述选择的氨基酸序列相比具有最多达4个改变的氨基酸序列。10.权利要求4要求保护的抗-SA免疫球蛋白单一可变结构域变体，其中，与D0M7h-ll相比，所述变体在FW3区中(57-88位，根据Kabat编号)或在CDR3区中(89-97位，根据Kabat编号)包含至少一个突变。11.权利要求7要求保护的抗-SA免疫球蛋白单一可变结构域变体，其中所述变体是D0M7h-ll-15(D0M7h-ll-15如图1中所示)的变体，与D0M7h_ll_15相比，在FW3区中(57-88位，根据Kabat编号)或在CDR3区中(89-97位，根据Kabat编号)包含至少一个突变。12.权利要求7或8要求保护的抗-SA免疫球蛋白单一可变结构域变体，其中所述变体在77、83、93或95位(根据Kabat编号)中任何位置包含至少一个突变。13.权利要求7-9中任一项的变体，其中所述变体包含选自下列的至少一个突变77 位=Asn、Gln83 位=Val、lie、Met、Leu、Phe、Ala 或正亮氨酸93 位=Val、lie、Met、Leu、Phe、Ala 或正亮氨酸95 位=His、Asn、Gin、Lys 或 Arg014.前述任一权利要求要求保护的抗-SA免疫球蛋白单一可变结构域变体，在106或108位(根据Kabat编号)进一步包括突变。15.权利要求14要求保护的抗-SA免疫球蛋白单一可变结构域变体，其中106位是Asn或 Gin。16.权利要求14要求保护的抗-SA免疫球蛋白单一可变结构域变体，其中108位是 Trp、Tyr 或 Phe017.前述任一权利要求要求保护的抗-SA免疫球蛋白单一可变结构域变体，其中77位是 Asn018.前述任一权利要求要求保护的抗-SA单一可变结构域，其中83位是Val。19.前述任一权利要求要求保护的抗-SA单一可变结构域,其中95位是His。20.前述任一权利要求要求保护的抗-SA单一可变结构域,其中95位是His。21.前述任一权利要求要求保护的抗-SA单一可变结构域，其中93位是Val。22.权利要求1的变体，其中所述变体包含与选自D0M7h-ll-57(SEQ ID N0:413)、 D0M7h-ll-65 (SEQ ID N0:414)、D0M7h_ll_67 (SEQ ID N0:415)和 D0M7h_ll_69 (SEQ ID N0:417)的单一可变结构域的氨基酸序列相同或者与所述选择的氨基酸序列相比具有最多达4个改变的氨基酸序列，条件是所述变体的氨基酸序列具有如权利要求1-12中任一项所定义的FW3或⑶R3区中的至少一个突变。23.权利要求10-21中任一项要求保护的变体，所述变体具有至少57°C的Tm。24.前述任一权利要求要求保护的变体，其中所述变体与D0M7h-ll相比具有增加的Tm值。25.前述任一权利要求要求保护的变体，其中所述变体与D0M7h-ll-15相比具有增加的Tm值。26.前述任一权利要求要求保护的变体，包括权利要求4和13中列出的任何突变的任何组合。27.前述任一权利要求的变体，其中所述变体包含结合位点，如表面等离子体共振所测定的，所述结合位点以约O.1-约10000 n...

【专利技术属性】
技术研发人员：E德安格利斯，C埃纳弗，H刘，O肖恩，M普佩卡斯维德，
申请(专利权)人：葛兰素集团有限公司，
类型：
国别省市：