与肝病进程相关的检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了保藏号为CGMCC?No.5269的单克隆抗体杂交瘤细胞株在制备肝病进程相关的检测试剂或试剂盒中的应用。本发明专利技术所提供的由所述杂交瘤细胞中分泌的单克隆抗体制备的试剂盒可通过血清样本中多肽标志物Pep5的定量检测，对肝病进程的发展进行有效的监测，而且操作步骤简便快捷，利于高通量地临床检测，检测成本低。

【技术实现步骤摘要】
与肝病进程相关的检测试剂盒及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及定量检测与肝病进程相关的酶联免疫吸附法 检测试剂盒及其应用。
技术介绍
肝硬化是一种常见的慢性肝病，是由一种或多种病因长期或反复作用引起的肝脏 弥漫性损害。肝纤维化是多种慢性肝病共有的组织学改变。肝纤维化是肝脏对慢性损伤的 一种修复反应，是慢性肝病共有的病理改变，不仅是向肝硬化发展的必由之路，而且贯穿于 肝硬化的全过程。目前“肝炎一肝纤维化一肝硬化一肝癌”，这一链条已被认为是各种慢性肝病导致 严重后果的共同途径。临床研究发现，肝纤维化的诊断方法主要包括影像学、病理学和血清 学诊断3种。影像学诊断主要是B超和CT，在临床应用广泛，但只能在肝纤维化晚期，发生 肝硬化和门脉高压症时才能出现异常图像，不能做出早期诊断。肝纤维化的诊断金标准虽 是肝组织活检，但其本身也存在许多问题，如肝穿刺的盲目性、取材不够、肝脏病变的不均 一性而导致取样误差；虽属于微创检查，但多数患者不愿接受，且不能反复取材进行动态观 察。肝纤维化是发展至肝硬化的必经阶段；临床数据表明，有80%的肝癌患者是由肝 硬化进一步恶化所至。因此，在肝纤维化阶段进行早期发现治疗，尚有好转的可能。由此可 以看出肝纤维化的临床诊断和治疗对于慢性肝病极为重要。因此迫切需要一种特异性强、结果可靠、操作性强、简单可行的对肝纤维化进行检 测，对肝病进程的发展进行有效监测的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供保藏号为CGMCC No. 5269的单克隆抗体杂交瘤细胞株在制 备肝病进程相关的检测试剂或试剂盒中的应用。本专利技术中，特异性定量检测多肽标志物P印5的单克隆抗体杂交瘤细胞株AP0105， 是以多妝标志物抗原(序列为 Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-Gln的多肽，命名为多肽5，简称P印5)与载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)的偶 联物免疫原，免疫BALB/C小鼠，然后筛选出的杂交瘤细胞株。本专利技术提供的特异性定量检 测肝病进程相关的多肽标志物P印5的单克隆抗体杂交瘤细胞株AP0105，已于2011年9月 27号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I 号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，保藏号为CGMCC No. 5269。本专利技术中，所述的检测试剂盒优选为酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒。其中，所述的ELISA试剂盒含有辣根过氧化物酶标记的本专利技术所述的单克隆抗 体。其中，所述的ELISA试剂盒还含有包被液、封闭液、显色液、终止液和固相反应板。其中，所述的ELISA试剂盒进一步含有对多肽标志物进彳丁足量检测用的校准品、 质控品。进一步，所述包被液优选为碳酸盐缓冲液、封闭液优选为5%脱脂奶粉、显色液优 选为TMB显色液、终止液优选为2M硫酸、固相反应板优选96孔聚丙乙烯微孔板。所述校准品、质控品为系列稀释度的Pep5稀释液。本专利技术的ELISA试剂盒在制备肝病进程相关的检测试剂或试剂盒中的应用，具体 包括以下步骤1)包被取5-30 u L临床血清，加入70 u L_95 u L包被液，置于96孔板中，4°C放 置过夜或37°C放置2小时；同时加入100 u L包被液作为阴性对照；2)清洗弃包被液，用0. 01M、pH7. 4 PBST缓冲液200-300 y L清洗5-7次，拍干；3)封闭加入200-300 u L 5%的脱脂奶粉，37°C静置封闭2小时；4)清洗弃封闭液，用0. 01M、pH7. 4 PBST缓冲液200-300 y L清洗5-7次，拍干；5)酶结合物加入80-120 uL HRP标记抗体，37°C静置1小时；6)清洗弃抗体溶液，用0. 01M、pH7. 4 PBST缓冲液200-300 u L清洗5-7次，拍 干;7)显色加入80-120iiL显色液，37°C避光孵育15min显色；8)终止加入30-70 u L 2M硫酸，终止反应；9)读数用酶联检测仪测定波长450nm的光吸收值；10)判别以检测0D值与阴性0D值之比大于2. 1为阳性。本专利技术中，术语“肝病进程”包括肝炎一肝纤维化一肝硬化一肝癌，肝纤维化是向 肝硬化发展的必由之路。针对上述技术方案，本专利技术具有以下优点和效果本专利技术中所阐述的多肽标志物Pep5定量检测试剂盒不仅可以特异性检测肝癌及 正常血清样本，也能通过血清样本中多肽标志物P印5的定量检测，对肝病进程的发展进行 有效的监测。本专利技术所提供的单克隆抗体针对多肽标志物抗原的特异性强；多肽标志物抗原的 检测方法的操作步骤简便快捷，利于临床检测；可进行高通量、低成本的酶联检测仪检测。附图说明图1为本专利技术所阐述的的多肽标志物P印5定量检测试剂盒在肝病发展进程‘肝 炎_肝纤维化_肝硬化_肝癌’血清与正常血清的P印5含量差异的箱式图。具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1多肽标志物抗原单克隆抗体的制备方法1)采用偶联载体蛋白KLH的合成的多肽5作为免疫原免疫BALB/C小鼠；其全长 序列为Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His_Gln。2)2周后检测尾血滴度，达到1 :1000以上后，取BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0小鼠 骨髓瘤细胞在PEG作用下进行融合；3)通过ELISA方法进行筛选，用有限稀释法对分泌抗体阳性的杂交瘤细胞进行克隆纯化；4)筛选出10株针对合成肽5的杂交瘤细胞，意外地发现其中一株敏感性较高(lng/well)，扩增细胞系，制备并纯化单抗腹水，检测单抗的效价(1:200000)、滴度 (O. 0005μ g/ml)及亚型鉴定(IgG2b)等，得到抗多肽5的特异性单克隆抗体。将该杂交瘤细胞株命名为抗人原发性肝癌多肽标志物单克隆抗体杂交瘤细胞株，并于2011年9月27 号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为CGMCC No. 5269。实施例2 P印5定量检测ELISA检测试剂盒的组装(1)1. 25 μ g/ml辣根过氧化物酶标记的实施例1的抗Pep5的特异性单克隆抗体；(2)包被液0.1M ρΗ9· 6的碳酸盐缓冲液；(3)封闭液5g/100ml脱脂奶粉；(4 )显色液过氧化氢/TMB显色液；(5)终止液2M硫酸;(6)校准品/质控品系列稀释度0_24ng/ml的P印5稀释液；(7) 96孔酶联板。实施例3多肽标志物抗原的ELISA检测方法样本临床确诊的肝炎血清50份、肝纤维化血清30份、肝硬化血清、肝癌血清103 份、正常血清160份。 检测过程(I)包被5 μ L临床血清,加入95 μ L包被液,置于96孔板中，4°C放置过夜；同时相应空中加入校准品及质控品；(2)清洗弃包被液，用O. 01M、pH7. 4 PBST缓冲液200 μ L清洗6次，拍干；(3)封闭加入300 μ L5%的脱脂奶粉，37°C静置封闭2小时；(4)清洗弃封闭液，用O. 01M、pH7. 4 PBST缓冲液200 μ L清洗6次，拍干；(5)酶结合物加入100 μ L辣根过氧本文档来自技高网...

【技术保护点】
保藏号为CGMCC?No.5269的单克隆抗体杂交瘤细胞株AP0105在制备肝病进程相关的检测试剂或试剂盒中的应用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：魏开华，肖汉族，孙云波，傅海媛，侯利平，黄亚娟，宋纯艳，杨保安，甄蓓，徐淑芳，张拓，王东茂，周晓明，原剑，
申请(专利权)人：北京正旦国际科技有限责任公司，湖南金健药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：