本发明专利技术提供了一种食管癌免疫质谱检测试剂盒，所述检测试剂盒含有保藏号为CGMCC?No.5269的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体和固相载体，所述单克隆抗体固定于所述固相载体上。本发明专利技术所涉及的单克隆抗体针对多肽标志物抗原的结合特异性强；采用免疫与质谱技术连用，能实现食管癌高通量、高灵敏度、高精确度的检测。此外，本发明专利技术属于分子水平诊断技术，与肿瘤影像学相比操作简单、成本低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术及质谱检测，具体地说，涉及一种食管癌免疫质谱检测试剂盒。
技术介绍
食管癌是常见的消化道恶性肿瘤。据统计，2008年全球食管癌新发病例为 482300,死亡病例为406800。食管癌分为食管癌和食管腺癌,在我国，食管癌是食管癌的主 要类型，尤其是在北方地区。近年来，虽然对食管癌的治疗取得了一些进展，但是食管癌的 死亡率仍居高不下。究其原因，主要是其早期症状具有隐蔽性和非特异性，临床发现和治疗 的食管癌患者大多已属中、晚期，早期食管癌与中、晚期食管癌的预后有很大差别，经综合 治疗的早期食管癌患者5年生存率可达90%以上，而中、晚期患者只有25%-40%。因此，开展 食管癌的早期诊断早期治疗是目前提高食管癌治疗效果的有效途径。而当食管病变局限于 黏膜或黏膜下时，患者可能尚无感觉或仅有诸如轻微的梗噎感、胸骨后烧灼感等非特异性 症状，使早期诊断食管癌非常困难。目前，国内外常采用的食管癌检测方法有脱落细胞学、内镜技术、标志物检查等方 法。食管上皮脱落细胞的获取方法有食管拉网及毛刷，经盐水冲洗、沉淀后做涂片检查。食 管拉网法是我国沈琼教授专利技术的，其特异度可达99%，敏感度为44%-90%，但由于这一方法 使受检者较为痛苦，难以作为普查手段在一般人群中开展，经过半个多世纪的实践发现， 在高发区食管拉网方法的受检率越来越低。内镜检查并进行活检是现今食管癌的主要确诊 手段，且随着其他技术与内镜的结合，产生了一些新的检查方法，明显提高了早期食管癌的 检出率，但其依然存在明显的缺陷，如可能会加重受检者的不适，诊断结果依赖于操作者的 经验和技巧等。运用组织标志物诊断食管癌，前提必然是要取得肿瘤组织或细胞，这只能通 过有创的、甚至繁琐的操作才能达到，并不适合人群普查。所以，积极寻找创伤小、检测方 便的食管鳞癌血清标志物检测方法成为当今临床诊断的热点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种食管癌免疫质谱检测试剂盒。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种食管癌免疫质谱检测试剂盒，其含有保藏号 为CGMCC No. 5269的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体和固相载体，所述单克隆抗体共价连 接于固相载体上。其中，所述固相载体为包被蛋白G或蛋白A的琼脂糖颗粒等。优选地，所述单克隆抗体可固定于固相载体上，如通过共价连接方式固定于包被 蛋白G或蛋白A的琼脂糖颗粒上。本专利技术选用的包被蛋白G或蛋白A的琼脂糖颗粒(Protein GAgarose/Protein A Agarose)是免疫沉淀的基质,与包被蛋白G或蛋白A的磁珠(Protein G magnetic beads/ Protein A magnetic beads)相比，更具成本低的优点。进一步地，本专利技术的食管癌免疫质谱检测试剂盒中还含有洗脱液，所述洗脱液任选 pH 值 2. 7 的 O. lmol/1 甘氨酸-HCl 溶液、5% 乙酸或含 O. l%(v/v) TFA 的 50-70% (v/v) ACN 溶液中的一种。本专利技术中，抗人食管癌多肽标志物单克隆抗体杂交瘤细胞株AP0105，是以多肽标志物抗原(序列为 Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-Hi s-Gln的多肽，命名为多肽5)与载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)的偶联物免疫原，免疫BALB/ C小鼠，然后筛选出的杂交瘤细胞株。本专利技术提供的抗人食管癌多肽标志物单克隆抗体杂交瘤细胞株AP0105 (即，抗人原发性肝癌多肽标志物单克隆抗体杂交瘤细胞株AP0105)现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路 I号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期2011年9月27日，保藏号为 CGMCC No. 5269。本专利技术还提供所述多肽免疫检测试剂盒的制备方法，该方法包括如下步骤将纯化后的单克隆抗体与固相载体悬浮液混合，使得终浓度为O. 15 μ g/μ L-1. 5 μ g/μ L，在 4°C旋转孵育15分钟-2小时，放置l_5min，沉淀，移出上清液，用100-200 μ L PBS缓冲液 (O. Olmol/1、ρΗ7. 4)清洗所述固相载体2_5次，即得所述检测试剂盒。本专利技术还提供一种食管癌免疫质谱检测方法，该方法包括如下步骤利用上述检测试剂盒从血清样品中分离多肽标志物抗原，用高通量的MALD1-T0F-MS检测洗脱液中的所述多肽标志物抗原，由此建立完整的多肽免疫质谱检测方法。为了将所述检测试剂盒中的与所述单克隆抗体原发生特异性结合的血清样品中的多肽标志物抗分离出来，使用洗脱液从所述固相载体上分离出所述多肽标志物抗原。具体地，所述食管癌免疫质谱检测方法包括如下步骤I)结合单克隆抗体与琼脂糖颗粒以共价键相互结合； 2)孵育将样品与结合了抗体的琼脂糖颗粒进行孵育；3)清洗经过孵育，使得待分析物结合到抗体上，并清洗琼脂糖，洗掉未与抗体结合的杂质；4)洗脱用洗脱液将待分析物洗脱下来；5)检测用MALD1-TOF MS检测，并对数据进行分析。优选地，所述食管癌免疫质谱检测方法包括如下步骤I)取15-25 μ I固相载体，置于Eppendorf管中，加入1. 56 μ g-31.1yg单克隆抗体，4°C旋转混合15分钟-2小时，放置l_5min，移出上清液，用O. 01M、pH7. 4PBS缓冲液 100-200 μ L清洗所得固相载体沉淀2-5次；2)取O. 48 μ g-24 μ g多肽标准品、10-50 μ L PBS，与步骤I)清洗后的所述固相载体混合，4°C旋转混合8-12h ；3)放置l_5min，移出上清液，用100-200 μ L PBS清洗沉淀2_5次；最后一次清洗时将其悬浮液移至另一干净Eppendorf管中；以避免抗原非特异附着在管壁，降低检测本底值；4)加入5-10 μ L洗脱液，吸排混合l_5min ；5)离心，取上清液，用MALD1-T0F-MS检测，得到多肽标准品质谱；6 )用40_60 μ I血清样品替代步骤2 )的多妝标准品，重复步骤2 ) _5 ),用MALD1-TOF-MS检测，测定血清样品中的多肽标志物抗原。其中，步骤5)中采用的检测条件为正离子检测模式，离子源加速电压为201^，队激光器，激光波长337nm,能量2000,离子延迟提取时间(Pulse ion extraction, PIE) 390ns, 质谱信号单次扫描累加2000次,使用peptide II standard kit (Bruker)离子峰校正(m/ z 700-m/z3500)，质量扫描范围 500_5000Da。本专利技术的食管癌免疫质谱检测方法操作简单，主要包括抗体固相化、多肽抗原孵育结合和质谱检测三个方面，即将包被蛋白G或蛋白A的琼脂糖颗粒与本专利技术的单克隆抗体混合孵育，抗体与蛋白G或蛋白A亲和结合后固相化，清洗，加入多肽抗原孵育，抗原与抗体特异性结合，清洗，洗脱液分离抗原，MALD1-T0F-MS检测。本专利技术中涉及的单克隆抗体针对多肽标志物抗原的结合特异性强；采用免疫与质谱技术连用，能实现食管癌高通量、高灵敏度、高精确度的检测。此外，本专利技术方法属于分子水平诊断技术，与肿瘤本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种食管癌免疫质谱检测试剂盒，其特征在于，其含有保藏号为CGMCC?No.5269的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体和固相载体，所述单克隆抗体固定于所述固相载体上。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：魏开华，肖汉族，孙云波，傅海媛，侯利平，黄亚娟，宋纯艳，杨保安，甄蓓，徐淑芳，张拓，王东茂，周晓明，原剑，
申请(专利权)人：北京正旦国际科技有限责任公司，湖南金健药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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