本发明专利技术设计酶活检测领域，具体地涉及饲用果胶酶DNS检测法。根据本发明专利技术的饲用果胶酶DNS检测法，其酶活定义为：1g酶粉或1mL酶液在pH3.5、37℃下，每分钟从浓度为2.25mg/mL的底物（Sigma?P9135）溶液中分解释放1μmol还原物质（表述为半乳糖醛酸）所需要的酶量为一个酶活单位U。本发明专利技术的检测果胶酶活性的DNS检测法确定了反应体系：包括反应温度、反应pH值、底物浓度、酶液与底物比例、反应总体系等各种参数；确保该方法操作简便，且重复性好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设计酶活检测领域，具体地涉及饲用果胶酶DNS检测法。
技术介绍
果胶酶是指能分解果胶物质的多种酶的总称，它在破解植物细胞壁、促进内源酶分泌及消除抗营养因子方面发挥了不可替代的作用，在饲料工业中越来越受到重视。但果胶酶是包含多种组分的复合酶，按作用方式分类可分为(I)解聚酶①聚甲基半乳糖醒酸酶 Polymethlgalacturonase PMG ②聚半乳糖醒酸酶 PolygalaturonasePG ③聚甲基半乳糖醒酸裂解酶Polymethlgalacturonatelyse PMGL④聚半乳糖醒酸裂解酶Polygalaturonatelyse PGL ; (2)果胶酯酶 Pectinesterase PE。按底物不同分类可分为果胶酯酶，果胶酶，原果胶酶。但是目前国内采用的果胶酶检测方法是次亚碘酸法(QB1502-92)，它存在以下问题1、底物无法完全溶解，配制出的底物批次间差异较大，且硫代硫酸钠标准溶液和碳酸钠溶液的稳定性较差，从而导致该方法的重复性很差，有时甚至会出现同一个样品今天能检测出酶活，明天却检测不出酶活的情况，对质量控制造成极大的困难。2、操作繁琐，所需试剂较多，有效的酶液浓度范围太窄，方法规定滴定差即消耗O.05mol/L硫代硫酸钠溶液(A-B)之差须在O. 5-1. Oml范围内，难以控制，经常要多次实验才能准确测出酶活，大大增加了操作时间与难度，且势必会增加实验成本。3、酶活定义与现行NSP酶国家标准有冲突，一般都定义为每分钟降解底物生成Iymol产物为I个酶活单位，但该法定义为每小时降解底物生成Img产物为I个酶活单位，造成了酶活被高估，造成用户困扰。因此，因此，果胶酶的检测一直是个难题，现有果胶酶检测方法需要亟待改进。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的是解决饲用果胶酶活性检测困难，提供一种改进的果胶酶DNS检测法。根据本专利技术的饲用果胶酶DNS检测法，所述方法包括以下步骤(I)吸取果胶粉溶液，加入DNS试剂并振荡，在37°C水浴锅中保温30min，再加入稀释的酶液，混匀，沸水浴煮沸，测定在540nm处测定吸光度Ab ；(2)吸取果胶粉溶液，加入与步骤(I)稀释同样倍数的酶液混匀，在37°C水浴中精确保温30min，加入DNS试剂，混匀，沸水浴煮沸，测定在540nm处测定吸光度AS ；(3)酶活计算酶活X= X 1000 X Df/30/m/MX :酶样中果胶酶活力，U/mL ；AS :酶反应液的吸光度；AB :酶空白样的吸光度；K :标准曲线的斜率A :标准曲线的截距；Df :稀释倍数;M :半乳糖醛酸的分子量212. 15g/mol ；m :果胶酶取样量，g或mL,其中，对于步骤(I)和步骤(2)，果胶粉溶液的pH为3. 5 ;果胶粉溶液与酶液的体积比为3 :1 ;在果胶粉溶液与酶液的混合液中，果胶粉的浓度为2. 25mg/mL。根据本专利技术的方法，对于步骤(I)和步骤(2)，在沸水浴煮沸的时间为5min，然后用自来水冷却至室温，加水定容并振荡混勻，IOOOOg离心lOmin。因此，根据本专利技术的饲用果胶酶DNS检测法，其酶活定义为Ig酶粉或ImL酶液在ρΗ3· 5、37 V下，每分钟从浓度为2. 25mg/mL的底物(SigmaP9135)溶液中分解释放Iymol还原物质(表述为半乳糖醛酸)所需要的酶量为一个 酶活单位U。根据本专利技术的饲用果胶酶DNS检测法的原理为果胶酶能将果胶降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中果胶酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中果胶酶的活力。根据本专利技术的饲用果胶酶DNS检测法确定了以下反应体系及反应条件反应温度一般饲用果胶酶最适温度在45_60°C之间，但应用环境(畜禽体温)在37-40°C，检测酶活是为了更好的表示其应用效果，故反应温度应该与实际应用温度保持一致，故选择37 °C。反应pH值畜禽胃肠道pH值为2. 0-5. 5，反应pH应该与实际应用环境中pH保持一致，故选择pH 3. 5。底物浓度QB 1502-92中规定果胶粉为10g/L，采用这个浓度的底物，样品空白值会比较高，且由于果胶粉不易溶解，此空白值也不稳定，严重影响方法的重复性。通过酶促反应动力学计算出果胶酶反应的Km值，再结合样品空白值的高低及检测结果的稳定性，最终选取了在果胶粉溶液与酶液的混合液中果胶粉的浓度为2. 25mg/mL。酶液与底物比例(体积比3 :1):按照酶促反应动力学所得Km值为1. 21，底物浓度应该选择10倍Km以上才能保证反应中底物过量，但是实际操作中底物浓度过高会造成空白吸光值太高，影响检测灵敏度及取值范围，因此选择稍低的底物浓度，以此来保证较低的空白值及相对过量的底物。检测波长根据波长扫描结果，产物在380_650nm之间均有吸收，最大吸收峰在450nm左右,但在410_480nm干扰较大,500-600nm之间数据较稳定波动小，并且梯度间吸光值差异明显，在这个范围取值都可以，选取了 540nm。根据本专利技术的方法可以确保此方法的重复性及重现性符合国家标准。根据现有的DNS方法检测果胶酶活性，果胶粉难溶于水，需加热煮沸才能完全溶解，但不同批次配制的底物间仍会存在一定差异；另外，在碱性环境中果胶粉不稳定，容易降解成一些絮状物质，该方法中空白样品中果胶粉会与碱性的DNS接触，造成重复性及重现性变差。本专利技术的检测果胶酶活性的DNS检测法确定了反应体系包括反应温度、反应pH值、底物浓度、酶液与底物比例、反应总体系等各种参数；确保该方法操作简便，且重复性好。通过实验验证，空白样品中通过先添加底物与DNS接触，让果胶粉在碱性环境中趋于稳定，不仅可降低空白值，数据也更稳定；另外，反应完成后经过IOOOOrpm离心IOmin也提高了方法的稳定性。附图说明图1为标准曲线。具体实施例方式实施例11、酶活定义 Ig酶粉或ImL酶液在ρΗ3· 5、37 V下，每分钟从浓度为2. 25mg/mL的底物(SigmaP9135)溶液中分解释放Iymol还原物质(表述为半乳糖醛酸)所需要的酶量为一个酶活单位U。2、测定原理果胶酶能将聚半乳糖醛酸降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中果胶酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中果胶酶的活力。3、试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。3.1氢氧化钠溶液，c (NaOH)为200g/L 称取氢氧化钠20. 0g，加水溶解，定容至100mL。3. 2D-半乳糖醛酸，c(C6HltlO7 -H2O)为1. Omg/mL 称取D-半乳糖醛酸O. 100g，加水溶解，定容至100mL。3. 30. lmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH=3. 5)甲液称取柠檬酸(C6H8O7 · H2O) 21. 01g，用水溶解并定容至1000mL。乙液称取柠檬酸三钠(本文档来自技高网...
【技术保护点】
饲用果胶酶DNS检测法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）吸取果胶粉溶液，加入DNS试剂并振荡，在37℃水浴锅中保温30min，再加入稀释的酶液，混匀，沸水浴煮沸，测定在540nm处测定吸光度AB；（2）吸取果胶粉溶液，加入与步骤（1）稀释同样倍数的酶液混匀，在37℃水浴中精确保温30min，加入DNS试剂，混匀，沸水浴煮沸，测定在540nm处测定吸光度AS；（3）酶活计算酶活X=[(AS?AB)×K+CO]×1000×Df/30/m/MX：酶样中果胶酶活力，U/mL；AS：待测酶反应液的吸光度；AB：待测酶空白样的吸光度；K：标准曲线的斜率；CO：标准曲线的截距；Df：待测酶样品的稀释倍数；M：半乳糖醛酸的分子量，212.15g/mol；m：待测果胶酶取样量，其中，对于步骤（1）和步骤（2），果胶粉溶液的pH为3.5；果胶粉溶液与酶液的体积比为3：1；在果胶粉溶液与酶液的混合液中，果胶粉的浓度为2.25mg/mL。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王冠，詹志春，徐丽，周樱，丁皓，付大波，周金敏，王晓亮，张庆丽，
申请(专利权)人：武汉新华扬生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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