本发明专利技术涉及一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBRGreenI荧光定量PCR检测方法，本发明专利技术方法步骤包括猪胞内劳森氏菌DNA的提取﹑引物设计﹑PCR扩增PPE的aspA基因片段﹑猪增生性肠炎的aspA基因的克隆与鉴定﹑标准质粒模板的制备﹑荧光定量PCR的扩增并获得扩增动力学曲线和标准曲线﹑特异性试验﹑敏感性试验﹑重复性和稳定性试验及临床病料样品检测。本发明专利技术方法具有良好的特异性﹑敏感性﹑重复性和稳定性，能够简便﹑快速﹑特异﹑敏感的对临床疑似PPE感染或发病猪进行准确的鉴别诊断和早期感染的检测监控。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细菌检测
，具体涉及一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBRGreen I荧光定量PCR检测方法。
技术介绍
猪增生性肠炎(porcine proliferative enteritis, PPE)是由猪胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis,LI)引起的猪的接触性传染病。胞内劳森氏菌是一种弯曲的专性胞内寄生菌，主要寄生在猪以及其他动物的回肠、结肠、盲肠部位，造成未成熟的肠道上皮细胞腺瘤样增生。目前，该病已呈全球性流行，隐性感染猪较多，损失易被忽视，亚洲地区的中国、日本、韩国及台湾地区近年来多次发生猪增生性肠炎，猪感染率后，导致顽固性·腹泻，造成猪只生长发育迟缓，严重降低饲料报酬率。另外该病经常存在混合感染其它病毒和细菌性疾病，致使临床症状表现更加复杂化，很难做出准确判断，特别是不易与仔猪副伤寒、猪传染性胃肠炎(TGEV)、猪流行性腹泻(PEDV)腹泻性疾病相区别等。因此，建立有效的鉴别诊断方法和检测系统成为进行其他研究的前提条件。荧光染料定量PCR技术是在反应管中加入荧光染料，这种染料可嵌入双链DNA，并且只有在嵌入到DNA后才能被激发产生荧光。随着扩增反应的延伸，荧光信号会因为DNA产物的增加而增加，因此SYBR Green I荧光信号的积累与扩增出的双链DNA的数量成正相关。目前将该方法应用到猪增生性肠炎胞内劳森氏菌检测上的尝试还不多见，本专利技术旨在建立针对猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的荧光定量PCR快速检测诊断方法，为该病的早期诊断防制及流行病学调查提供技术支持，同时为PPE的分子检测试剂盒的研制打下良好的基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，该方法具有操作简便，敏感性高，重复性好，污染少，用时短和可自动定量分析等优点，能够检测出常规PCR无法检测的病料，同时也免去了 DNA水平电泳的步骤，更加省时，为该病的早期诊断防制及流行病学调查提供技术支持。本专利技术的技术方案是通过如下步骤来实现的(I)将回肠或盲肠等病料剪碎后，加入5ml的PBS进行研磨，加入浓度均是1000U/ml的青、链霉素各lml，将组织悬液放入-20°C条件下，反复冻融3次，融化后于12000 rpm离心5111；[11,取上清,加入505、蛋白酶1(混勻，501€下裂解1.511,加入体积比酹:氯仿为1:1的酚和氯仿，使病料组织变性，利于DNA的释放，取下层抽提，取上清液加体积比氯仿异戊醇为1:1的氯仿和异戊醇，提取和纯化DNA，去除其它杂质，再抽提I次，取上清液加1/10体积3M/L的NaAc, 2倍体积无水乙醇，于-20°C下沉淀lh,4°C下12000rpm,离心IOmin,弃上清液，沉淀即为DNA，用75%乙醇冲洗2次，缓慢倒出乙醇，将沉淀室温晾干，加入适量ddH20溶解DNA，于_20°C保存或立即做PCR检测。(2)根据GenBank中的LI aspA基因(AY280626)，设计一对特异性引物，引物序列如下PPE-1-F 5—TAT, GGC，TGT，CAA，ACA，CTC，CG-3PPE-1-R 5—TGA, AGG，TAT，TGG，TAT，TCT，CC-3其中PPE-1-F / R预期扩增片段为227bp。(3)加入 PCR Mix 12. 5 μ L, 10 ρΜ 上、下游引物各 I μ L，Rnase Free water 8.5μ L，DNA模板或重组质粒2. O μ L，将EP管置PCR仪，按如下程序进行扩增94°C 5min ；94°C30s,55°C 30s,72°C 40s，共35个循环；72°C延伸10 min，反应结束后，取5μ PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，将扩增的PCR产物经2%的凝胶电泳分析并回收、纯化。 (4)将回收纯化后的PCR产物连接到pMD18- T Vector上，转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑取单个菌落接种至培养液中过夜振荡培养，提取重组质粒，以提取的质粒DNA作为模板进行PCR鉴定，并将重组质粒进行测序鉴定。(5)提取经过测序鉴定正确的重组质粒，应用紫外分光光度计测定重组质粒浓度，计算出基因拷贝数，将重组质粒进行10倍系列稀释，共做6个稀释度IO2, IO3, IO4, IO5, IO6, 107，将其作为标准质粒模板。(6)取标准质粒模板，构建反应体系，进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增，获得扩增动力学曲线及标准曲线。(7)分别以TGEV、RV、PEDV反转录后的cDNA和大肠杆菌、沙门氏菌、LI阳性对照的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，同时设NTC。验证本专利技术方法的特异性。(8)将已计算出拷贝数的质粒做10倍梯度稀释，选取ΙΟ'ΙΟ-'ΙΟ'ΙΟ—12、10_13稀释的五个浓度梯度进行荧光定量PCR检测，以此确定出荧光定量PCR所能检出的最低模板拷贝数，验证本专利技术方法的敏感性。(9)将已知的标准品分别进行批内、批间重复性试验，验证本专利技术中方法的稳定性和重复性。(10)对采自山东省内疑似PPE发病猪的盲肠、回肠组织样品及粪便样品处理后，分别进行荧光定量PCR检测和常规PCR扩增，同时设阳性标准对照和阴性对照，用于对比本专利技术方法的优良之处。其中本专利技术所述步骤6-10中，所述的荧光定量PCR反应体系如下总反应体积25uL，其中 ddH20 10. 5ul，上游引物 0. 5ul，下游引物 0. 5ul，2X0ne Step SYBR Green IPremix预混酶12. 5ul,质粒模板Iul ;突光定量PCR反应条件如下94°C预变性3 min ；940C 30 s，56°C30s，72°C30s，同时在72°C延伸过程中收集荧光信号，40个循环，同时设溶解曲线反应循环参数为95°C 15 s，60°C 30 s，95°C 15 S。其中将提取的质粒经紫外分光光度计量，标准质粒以10倍梯度稀释为1.75X IO9-L 75X 104拷贝/ uL的阳性质粒模板进行荧光定量PCR反应，建立荧光定量PCR标准曲线。其中本专利技术中Ct值与质粒拷贝数的对数之间呈现出良好的线性关系，相关系数为为R2=O. 9979，斜率为-4. 0055，截距为41. 1919，从而可以得出拷贝数x与Ct值之间的线性关系曲线方程式Ct = -4. 0055X IgX +41. 1919，而待测样品的Ct值可以从实验结果中直接读取；把待测样品的Ct值代入表达式就可以计算出其初始拷贝数(X)。其中在反应结束后进行溶解曲线分析，扩增产物的溶解温度Tm为85. 0-85. 3°C,无非特异性产物和引物二聚体的峰值出现，标准品均一稳定。其中分别以TGEV、RV、PEDV反转录后的cDNA和大肠杆菌、沙门氏菌、PPE阳性对照的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，同时设NTC。这2次扩增PEE质粒模板均出现特异性的扩增动力学曲线，而TGEV、RV、PEDV、大肠杆菌、沙门氏菌均未出现出相应的扩增动力学曲线，表明该方法具有较好的特异性。其中分别进行批内、批间重复试验。批内重复实验验的变异系数CV值平均为O.76%，批间重复实验的变异系数CV值平均为1. 41%，表明建立荧光定量检测方法具有很好的稳定性。批内重复实验的变异系数均本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBR?Green?I荧光定量PCR检测方法，其特征在于其检测方法的具体步骤如下:（1）提取猪胞内劳森氏菌的DNA，制备检测液；（2）根据GenBank中的LI?aspA基因（AY280626），设计一对特异性引物，引物序列如下：PPE?1?F：5??TAT，GGC，TGT，CAA，ACA，CTC，CG??3PPE?1?R：5??TGA，AGG，TAT，TGG，TAT，TCT，CC??3其中PPE?1?F／R预期扩增片段为227bp；（3）加入PCR?Mix?12.5?μL，10?pM上、下游引物各1?μL，Rnase?Free?water?8.5?μL，DNA模板或重组质粒2.0μL，将EP管置PCR仪，按如下程序进行扩增：94℃?5min；94℃?30s、55℃?30s、72℃?40s，共35个循环；72℃延伸10?min，反应结束后，取5μL?PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，将扩增的PCR产物经2%的凝胶电泳分析并回收﹑纯化；（4）将回收纯化后的PCR产物连接到pMD18??T?Vector上，转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑取单个菌落接种至培养液中过夜振荡培养，提取重组质粒，以提取的质粒DNA作为模板进行PCR鉴定，并将重组质粒进行测序鉴定；（5）提取经过测序鉴定正确的重组质粒，应用紫外分光光度计测定重组质粒浓度，计算出基因拷贝数，将重组质粒进行10倍系列稀释，共做6个稀释度：102,103,104,105,106,107，将其作为标准质粒模板；（6）取标准质粒模板，构建反应体系，进行SYBR?Green?I荧光定量PCR扩增，获得扩增动力学曲线及标准曲线；（7）分别以TGEV、RV、PEDV反转录后的cDNA和大肠杆菌、沙门氏菌﹑LI阳性对照的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，同时设NTC，,验证本专利技术方法的特异性；（8）将已计算出拷贝数的质粒做10倍梯度稀释,选取10?9、10?10、10?11、10?12﹑10?13稀释的五个浓度梯度进行荧光定量PCR检测,以此确定出荧光定量PCR所能检出的最低模板拷贝数，验证本专利技术方法的敏感性；（9）将已知的标准品分别进行批内、批间重复性试验，验证本专利技术中方法的稳定性和重复性；（10）对采自山东省内疑似PPE发病猪的盲肠、回肠组织样品及粪便样品处理后，分别进行荧光定量PCR检测和常规PCR扩增，同时设阳性标准对照和阴性对照，用于对比本专利技术方法的优良之处。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭显坡，陈申秒，蔡培军，
申请(专利权)人：山东滨州沃华生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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