碱性艳兰BO在DNA检测中的应用制造技术

本发明专利技术涉及碱性艳兰BO(Victoria?pure?blue?BO，VPBBO)在琼脂糖凝胶上对DNA染色的方法，其中染色液为pH为6-8的含碱性艳兰BO的溶液。另外，本发明专利技术还涉及基于上述方法的在琼脂糖凝胶上检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒等。本发明专利技术具有灵敏度高、操作简单迅速、重现性好、染色背景低、线性范围广、可逆性强、使用安全、成本低廉等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测
，具体而言，本专利技术涉及碱性艳兰BO(VPBBO)在琼脂糖凝胶上对DNA染色的方法，其成本低、步骤简单、操作时间短、灵敏度高而且染色后的背景颜色浅。另外，本专利技术还涉及检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒等。
技术介绍
在生命科学研究领域中，作为生物体内的重要大分子，DNA是研究生命现象与本质的物质基础，其主要功能是储存、传递和表达生物体的遗传信息，DNA与生命的异常现象的发生和遗传性疾病等紧密关联。近年来随着基因组学、功能基因组学和结构基因组学的快速发展，它的应用范围越来越广，几乎渗透到生命科学的各个领域。因此，如何进一步研究 和发展高灵敏度、高选择性和简便快捷的DNA测定新体系与新方法，自然成为分析研究工作者关注的研究方向。目前，琼脂糖凝胶电泳是高效分离和分析DNA分子的一种常用方法，使得凝胶上DNA的检测技术对DNA的相关研究起着至关重要的作用。测定DNA含量的方法有多种，目前用于琼脂糖上DNA研究和测定的方法有荧光染色法、染料染色法、负染法、银染法等。DNA荧光检测法因具有快速便捷、灵敏度高等优点而成为常用的DNA检测方法之一，其使用诸如溴化乙锭(EB)、SYBR green、SYBR gold等荧光染料，如紫外光线(UV)的照射下发出荧光，可用于检测琼脂糖凝胶上的DNA条带。然而，这些荧光染料都具有一些不可克服的缺点，尤其是EB，由于其能嵌入DNA分子双螺旋结构中，可破坏DNA样品，从而具有较强的致畸致突变作用，对实验操作者具有潜在危险；此外EB检测的凝胶需要在紫外灯下进行检识，而紫外射线常常导致核酸杂交、聚合，对其结构产生影响。，同时荧光检测仪器设备成本也比较高。因此，肉眼可见、操作简单、无毒、低成本的可视有机染料成为替代荧光染料为DNA染色的选择之一。已经有一些报道公开了可视有机染料用于琼脂糖凝胶上DNA的染色方法，如亚甲蓝、亮甲酚蓝、结晶紫、以及尼罗河蓝等。但是，这些染料染色和脱色时间长，而且灵敏度较低，普遍不如荧光染料。为此，本专利技术人经过长期实践研究，令人惊讶地在发现成本低的碱性艳兰BO (Victoria pure blue B0,VPBB0)可用于在琼脂糖凝胶上对DNA染色，其可以在10分钟的染色时间内检测出低至0.8-1. 6ng级的DNA，灵敏度是尼罗蓝(NB)的四倍，近似EB等荧光染料的灵敏度。另外，本专利技术人还专利技术了基于上述染色法的检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供VPBBO染色法，其能对在琼脂糖凝胶中的DNA染色，该方法安全、操作方便、成本低，而且灵敏度高。另外，本专利技术的目的还在于提供检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒等。VPBBO是一种无毒性的萘基二苯甲烷类染料，其结构式如图1所示。本专利技术人经研究发现，VPBBO的分子结构和DNA分子具有很强的亲和力，但是VPBBO分子结构和琼脂糖结合的能力则弱得多，从而能够使DNA (相对于琼脂糖凝胶基质)显出颜色。优选在本专利技术的第一方面中，所述染色液中碱性艳兰BO的浓度为0.001%至0.01%，优选为0.003%至0.008%，最优选为0.005%。本专利技术人经研究发现，VPBBO浓度过低，则染色后的颜色强度会有下降，而浓度过高，VPBBO会使背景也过多地染上色，从而降低图像的对比度，如图2。另外，在本文中如未特别指出，所述“溶液”均为水溶液，即溶剂为水，优选明示出其中所含的溶质为所述溶液中的全部溶质；也优选对于液体溶质来说，其百分比浓度指的是体积百分比浓度，而对于固体溶质来说，其百分比浓度指的是质量百分比浓度。在现有的染色方法中，有机溶剂常用来作为染色的介质或固定剂，用以提高染色强度，从而提高灵敏度。本专利技术人经研究发现，加入有机溶剂乙醇能更好的溶解VPBBO并能有效提高琼脂糖凝上的DNA染色强度。所述染色液中乙醇浓度为5%至50%，优选5%至·20%，最优为10%。优选所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、甘油和丙二醇之一或多种。在现有的染色方法中，无机盐常用来降低凝胶背景上染色的程度。本专利技术人经研究发现，加入无机盐NaHCO3后可使凝胶背景上的染色强度达到最强。所述染色液中NaHCO3浓度为0. 01 %至5%，优选0. 05%至I %，最优为0.1 %。优选所述无机盐选自NaHC03、NaCl、MgCl2、ZnCl2和(NH4)2SO4之一或多种。最优选，本专利技术第一方面所述的方法中所述的染色液是VPBBO的溶液，其中溶质含VPBBO和NaHCO3,溶剂为含10%乙醇的水溶液。染色后，需将琼脂糖凝胶进行脱色，以洗去其表面残留的染色液，然后用于观察结果。优选在本专利技术的第一方面，所述方法包括在染色后洗涤的步骤。更优选本专利技术第一方面所述的方法由将琼脂糖凝胶浸入含碱性艳兰BO的染色液中染色的步骤和在染色后洗涤的步骤组成。在本文中，“洗涤”指的是用溶剂清洗琼脂糖凝胶，用以洗去上一步骤残留在琼脂糖凝胶上的试剂。其中，优选溶剂是醇、水、生理盐水或缓冲液，如Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液等。洗涤的时间为I至30分钟，优选是I分钟至10分钟。优选洗涤是先用醇洗然后用水洗。在本专利技术的具体实施方式中，先用40%乙醇溶液，I %冰醋酸水溶液冲洗2-3分钟，接着用去离子水清洗I分钟。在本专利技术的第一方面中，染色的时间为至少5分钟。本专利技术人研究发现，染色的时间可以不必过长。因此出于节约操作时间的考量，优选在本专利技术的第一方面中，染色的时间优选为5至240分钟，更优选为10至45分钟，最优选为10分钟。在第二方面，本专利技术的目的在于提供用于本专利技术第一方面所述方法的试剂盒，其包括分装的PH为6-8的含碱性艳兰BO的染色液。所述试剂盒还可以包括分装的醇，如40%乙醇，I %冰醋酸溶液。更优选所述试剂盒中染色液中各组分的含量如本专利技术第一方面所优选的那样。尽管不优选，但是所述试剂盒还可以包括分装的水，如去离子水。在本文中，试剂盒具有本领域技术人员所能理解的含义，在本文中，其包括分开的容器，分别包装(即，分装)不同的溶液。这样，不同的溶液之间不会发生混合。其中，容器是任何能够保存其所储存的溶液的容器，如玻璃瓶、塑料罐等，优选是能够长期保存其所储存的溶液的容器。另外，优选本专利技术第二方面的试剂盒还包括记载有本专利技术第一方面所述方法的说明书。说明书可以是独立的，如纸质说明书，其被放入试剂盒中；说明书也可以是直接印刷在试剂盒上的，如可以印刷在试剂盒中的一个或多个容器上。在第三方面，本专利技术的目的在于提供在琼脂糖凝胶上检测DNA的方法，其包括在琼脂糖凝胶上进行电泳，然后进行本专利技术第一方面所述的方法。琼脂糖凝胶电泳是本领域常规的技术，其方法步骤及使用的试剂、设备可参见《分子克隆实验指南》(科学出版社，2002)等书籍或实验手册，也有许多已经商品化了。在第四方面，本专利技术的目的在于提供用于本专利技术第三方面所述方法的试剂盒，其包括分装的琼脂糖凝胶电泳试剂和PH为6-8的含碱性艳兰BO的染色液。琼脂糖凝胶电泳试剂是本领域技术人员所熟知的，其可以通过商业渠道容易地购买。所述试剂盒还可以包括分装的醇，如40%乙醇，I %冰醋酸溶液。更优选所述试剂盒中染色液中各组分的含量如本专利技术第一方面所优选的那样。尽管不优选，但是所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
在琼脂糖凝胶上对DNA染色的方法，其特征在于，所述方法包括将琼脂糖凝胶浸入pH为6?8的含碱性艳兰BO的染色液中染色。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：金利泰，丛维涛，
申请(专利权)人：温州安得森生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：