本发明专利技术公开了一种AKT1基因检测特异性引物和液相芯片，该液相芯片主要包括有：每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为：针对E17K位点的SEQ?ID?NO.5及SEQ?ID?NO.6；和/或针对E49K位点的SEQ?ID?NO.7及SEQ?ID?NO.8；有anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明专利技术所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，实现多个突变位点的野生型和突变型并行检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种AKTl基因突变检测特异性引物和液相芯片。
技术介绍
AKT是病毒癌基因v-akt的人类同源基因，编码丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，在PI3K相关的信号通路中起重要的作用，影响细胞的生存、增殖和侵袭，参与包括细胞凋亡和葡萄糖代谢在内的细胞过程。目前研究表明，在肺癌和乳腺癌中，AKT基因激活与化疗药物抗性显著相关，AKTl基因表达升高被认为是肺癌细胞对顺钼抗性的原因；而在乳腺癌细胞的研究中，AKT激活显著增强其对化疗药物的抗性。此外，在超过90%的非小细胞肺癌中发现了 AKT基因的持 续激活且引起PI3K抑制剂和放射治疗的抗性。目前，AKTl基因的疗效相关突变主要有E17K和E49K，E17K(49G > A)突变是第17位的密码子编码的谷氨酸突变为赖氨酸，该突变改变了对激酶抑制剂的敏感性，而E49K(G145A)是第49位密码子编码的谷氨酸突变为赖氨酸，AKTl基因突变已成为药效研究的热点。目前，对AKTl基因突变进行检测和分析的方法很少，主要有直接测序法和PCR-RFLP分析法，其中最常用的方法有PCR-RFLP分析法。PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。再次，以上这些方法都存在着检测通量的局限性，每次只能检测一种突变类型，不能满足实际应用的需要。专利技术内容本专利技术的目的之一是提供AKTl基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于单项或者并行检测AKTl基因两种常见基因型E17K和E49K的野生型和突变型。实现上述目的的技术方案如下一种AKTl基因突变检测液相芯片，包括有(A).针对AKTl基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为针对E17K位点的SEQ ID NO. 5及SEQ ID NO. 6 ;和/或针对E49K位点的 SEQ ID NO. 7 及 SEQ ID NO. 8 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 4 ；(B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID NO. 9 SEQ ID NO. 12，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。优选地，所述扩增引物为针对E17K、E49K位点的SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14。优选地，所述ASPE引物为针对E17K位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 5组成的序列及由SEQ ID NO. 2及SEQ ID NO. 6组成的序列；和/或针对E49K位点的由SEQ IDNO. 3和SEQID NO. 7组成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 8组成的序列。本专利技术的另一目的是提供用于AKTl基因突变检测的特异性引物。实现上述目的的技术方案如下用于AKTl基因突变检测的特异性引物，其为针对E17K位点的SEQ ID NO. 5及 SEQ IDN0. 6 ;和 / 或针对 E49K 位点的 SEQ ID NO. 7 及 SEQ ID NO. 8。本专利技术的主要优点在于1.本专利技术所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100%。且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的AKTl基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及ant1-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、ant1-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。2.本专利技术通过专利技术人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本专利技术设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3% ;除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检测效果一致。3.本专利技术的检测方法步骤简单，两种突变位点检测可通过一步PCR即可完成I条目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。4.本专利技术不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。具体实施例方式实施例1AKTl基因突变检测液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物针对AKTl基因两种常见基因型E17K和E49K的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示表IAKTl基因的ASPE弓丨物序列(tag序列+特异性引物序列)权利要求1.一种AKTl基因突变检测液相芯片，其特征是，包括有(A).针对AKTl基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为针对E17K位点的SEQ ID NO. 5及SEQ ID NO. 6 ;和/或针对E49K位点的SEQID NO. 7 及 SEQ ID NO. 8 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 4 ；(B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID NO. 9 SEQ ID NO. 12，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。2.根据权利要求1所述的AKTl基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为针对 E17K、E49K 位点的 SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14。3.根据权利要求1所述的AKTl基因突变检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为针对E17K位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 5组成的序列及由SEQ ID NO. 2及SEQ IDNO. 6组成的序列；和/或针对E49K位点的由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 7组成的序列及由SEQ IDN0. 4和SEQ ID NO. 8组成本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种AKT1基因突变检测液相芯片，其特征是，包括有：(A).针对AKT1基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为：针对E17K位点的SEQ?ID?NO.5及SEQ?ID?NO.6；和/或针对E49K位点的SEQ?ID?NO.7及SEQ?ID?NO.8；所述tag序列选自SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.4；(B).有anti?tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti?tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti?tag序列选自SEQ?ID?NO.9～SEQ?ID?NO.12，且所述anti?tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许嘉森，吴诗扬，
申请(专利权)人：广州益善生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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