在动物细胞或动物组织中表达外源基因的方法技术

本发明专利技术公开了一种在动物细胞或动物组织中表达外源基因的方法。本发明专利技术提供了一种将外源基因导入哺乳动物细胞或组织中进行基因呈递的家蚕杆状病毒载体，包括骨架载体家蚕杆状病毒BmNPV以及重组到骨架载体上的外源基因的表达盒；所述外源基因的表达盒由哺乳动物启动子、外源基因和终止子组成。本发明专利技术进一步公开了一种在动物细胞或动物组织中表达外源基因的方法，包括：将构建的家蚕杆状病毒载体感染昆虫宿主或昆虫细胞；培养被感染的昆虫宿主或昆虫细胞对家蚕杆状病毒载体进行扩增；收获并纯化所扩增产物。本发明专利技术所构建的家蚕杆状病毒基因呈递载体在动物细胞中具有不可扩增、不会与动物细胞基因组进行重组、体外大量扩增方便、安全性高等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种表达外源基因的方法，尤其涉及一种将外源基因导入到动物细胞或动物组织中并进行表达的方法，属于基因治疗领域。
技术介绍
·基因治疗自从1990年成功应用于SCID-Xl患者的治疗至今已经有二十几年，一直以来基因治疗的研究的很大的侧重点在于基因转移载体的选择。由于将外源基因呈递到机体内的真核细胞中并表达的工作基本上是需要病毒载体来完成的,所以各种病毒载体在临床基因治疗中的选择和应用，在这些年来也是一个研究的重点，其中腺相关病毒载体(adeno-associated virus, AAV)是最近研究中最为成功的，但同时也存在一些问题。目前，国内外关于基因治疗载体的选择问题开始偏向于杆状病毒载体，其中，最常用的是杆状病毒载体是 Autographa californica multiple nucleopoIyhedrovirus(AcMNPV);它是一类专一性感染节肢动物的大型杆状包膜病毒，90-180Kb之间的环状双链DNA基因组包装在杆状衣壳内。由于近年来关于其研究越来越多并且越来越深入，力口之其操作安全方便，在用于各种外源基因的表达并作为一种新型的基因治疗载体方面受到高度重视(Cory and Bishop, 1997, Molecular Biotechnology, 303-313)。有些早期初步探索中阐述有一些杆状病毒作为基因转移表达载体在哺乳动物细胞中作用的困难和缺点(Sandig et al. , 1996, Journal of Molecular Medicine, 205-212),但是在最近的研究中发现杆状病毒作为一种新型的哺乳动物细胞基因转移载体具有过去所采用的一些载体所不具备的特点，如重组杆状病毒构建方便，易于大规模体外培养；外源基因容量大；感染哺乳动物细胞后不具备细胞毒性，安全性好，不会整合到细胞的基因组中，不会进行病毒DNA复制，其自身启动子在哺乳动物细胞内没有活性等。然而，用AcMNPV做为哺乳动物的外源基因呈递(基因治疗)的载体存在着非常难以克服的困难，即动物血液中的补体成分能够灭活AcMNPV病毒粒子，使外源基因导入哺乳动物细胞的效率非常低，由此失去实用价值(Sandig et al.,1996, Hum. Gene Ther. 7:1937-1945 ；Hofmann and Strauss, 1998, GeneTher. 5:531-536)。上述问题限制了杆状病毒AcMNPV在基因治疗中的应用范围，使其应用范围基本限于哺乳动物细胞，而不能用于生物个体的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种将外源基因导入哺乳动物细胞或生物个体的各个组织中进行基因呈递的家蚕杆状病毒载体；本专利技术的目的之二是提供一种构建所述基因呈递的家蚕杆状病毒载体的方法；本专利技术的目的之三是提供一种。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的一种将外源基因导入哺乳动物细胞或生物个体的组织中进行基因呈递的家蚕杆状病毒载体，包括骨架载体以及重组到骨架载体上的外源基因的表达盒；所述骨架载体是家蚕杆状病毒BmNPV DNA ；所述外源基因的表达盒由启动子、外源基因和终止子组成；其中，所述启动子是哺乳动物启动子，所述哺乳动物启动子可以是CMV启动子、人巨细胞病毒早期启动子(CMV-1E)、人延伸因子1-亚基启动子、Rous肉瘤长末端重复序列、人Ieukosialin基因启动子、鼠3-磷酸甘油激酶I (PGKI)基因启动子、人泛素蛋白(ubiquitin)C基因启动子、由鸡肌动蛋白启动子和CMV增强子序列构成的杂合启动子或鼠乳房瘤病毒(MMTV)启动子等，优选为CMV启动子(其核苷酸序列为SEQ ID No. 3所示)或CAG启动子；所述的终止子优选是SV40-polyA尾终止子(其核苷酸序列为SEQ ID No. 4所示)。所述的外源基因可以是报告基因(例如，可以是绿色荧光蛋白EGFP基因或荧光素酶报告基因(SEQ ID No. 2))、抗原基因、治疗遗传病用的相关基因、抑癌基因、其它功能基因或RNAi等。 本专利技术提供了一种将外源基因导入哺乳动物细胞或生物个体的组织中进行基因呈递的家蚕杆状病毒载体的构建方法，该方法包括(I)将外源基因的表达盒克隆到转移载体上，构建得到含有外源基因的重组转移载体；(2)将所构建的含有外源基因的重组转移载体与杆状病毒共转染昆虫细胞进行同源重组，即得。其中，所述外源基因的表达盒由哺乳动物启动子、外源基因和终止子组成；所述哺乳动物启动子是CMV启动子、人巨细胞病毒早期启动子、人延伸因子1-亚基启动子、Rous肉瘤长末端重复序列、人Ieukosialin基因启动子、鼠3-磷酸甘油激酶I基因启动子、人泛素蛋白C基因启动子、由鸡β_肌动蛋白启动子和CMV增强子序列构成的杂合启动子或鼠乳房瘤病毒启动子；所述的终止子优选是SV40-polyA尾终止子；所述的转移载体优选是PVL1393转移载体；所述的外源基因可以是报告基因、抗原基因、治疗遗传病用的相关基因或抑癌基因等；其中，所述的报告基因优选是绿色荧光蛋白EGFP基因或荧光素酶报告基因；所述的杆状病毒是BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV, EoSNPV、HaNPV, HzNPV,LdMNPV, MbMNPV, OpMNPV, SIMNPV, SeMNPV 或 TeNPV ;优先为家蚕杆状病毒 BmNPV。本专利技术进一步提供了一种将外源基因导入动物细胞或动物组织并进行表达的方法，包括将本专利技术所构建的家蚕杆状病毒载体感染昆虫宿主或昆虫细胞；培养被感染的昆虫宿主或昆虫细胞对家蚕杆状病毒载体进行扩增；收获并纯化所扩增的产物。所述的昆虫宿主优选为家蚕、野蚕、蓖麻蚕、樟蚕、樗蚕、柞蚕、日本柞蚕、野天蚕、苜蓿尺蠖、茶尺蠖、甘兰夜蛾、秋粘虫、粉纹夜蛾、行军虫、棉铃虫、美国棉粘虫、烟青虫、烟草夜蛾、东方粘虫或舞毒蛾；所述的昆虫细胞优选是家蚕细胞、野蚕细胞、蓖麻蚕细胞、樟蚕细胞、樗蚕细胞、昨蚕细胞、日本昨蚕细胞、野天蚕细胞、苜猜尺蠖细胞、茶尺蠖细胞、甘兰夜蛾细胞、秋粘虫细胞、粉纹夜蛾细胞、行军虫细胞、棉铃虫细胞、美国棉粘虫细胞、烟青虫细胞、烟草夜蛾细胞、东方粘虫细胞或舞毒蛾细胞；所述的感染是将家蚕杆状病毒载体通过口食来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体；优选的，所述的感染是将家蚕杆状病毒载体感染家蚕细胞或将家蚕杆状病毒载体穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹体，在感染3-6天后收集含重组杆状病毒的家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆；其中，所述的蛹体优选为1-2天的早期嫩蛹。呈递外源基因DNA的骨架载体是家蚕杆状病毒BmNPV，该呈递骨架载体前面的启动子为家蚕表达用的启动子，在哺乳动物细胞中不能进行表达；为此，本专利技术将外源基因克隆到转移载体上的哺乳动物启动子和终止子SV40之间，构建了用于转移外源基因的重组转移载体，然后通过和家蚕杆状病毒BmNPV共转染昆虫细胞进行同源重组得到重组杆状病毒；所获得的重组杆状病毒可以将外源基因导入哺乳动物细胞(非洲绿猴肾细胞veix)细胞和人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y)或 生物个体的各个组织中进行基因呈递。为了便于检测，本专利技术分别以绿色荧光蛋白E本文档来自技高网...

【技术保护点】
将外源基因导入哺乳动物细胞或生物个体的组织中进行基因呈递的家蚕杆状病毒载体，其特征在于：包括骨架载体以及重组到骨架载体上的外源基因的表达盒；所述骨架载体是家蚕杆状病毒BmNPV?DNA；所述外源基因的表达盒由哺乳动物启动子、外源基因和终止子组成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张志芳，姚斌，李轶女，易咏竹，刘兴健，张渭蛟，沈桂芳，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：