一种编码延胡索酸还原酶的基因?frd1A，具有下列核苷酸序列之一：1）序列表No.1的DNA序列；2）序列表No.２的氨基酸残基的序列。序列表中序列1的DNA从5’端第1个核苷酸开始起始密码子ATG到444个碱基以终止密码子TAG结束，存在一个完整的ORF，自5’端的第1-3位核苷酸为frd1A基因的起始密码子ATG，自5’端的第442-444位核苷酸为frd1A基因的终止密码子TAG。本发明专利技术所提供的延胡索酸还原酶及其编码酶的基因对研发新的生物工艺生产琥珀酸具有重要的意义和广泛的用途。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种延胡索酸还原酶及其编码酶的基因与应用。
技术介绍
琥珀酸，又名丁二酸，是一种具有重要应用价值的生物基平台化合物，能够作为化学原材料被广泛应用于合成药品及生物可降解性聚合物。目前主要利用化学合成法生产琥珀酸，然而，传统上的化学法成本高，易造成环境污染，限制了琥珀酸作为基本化工原料的广泛应用。因此，以微生物发酵法生产琥珀酸的研究与开发显得越来越重要。而作为微生物法生产琥珀酸的关键酶一延胡索酸还原酶，对其研究也就受到广泛的重视。延胡索酸还原酶(fumarate reductase, Frd, EC L 3.1. 6),主要催化延胡索酸还原为琥珀酸，是很多生物厌氧呼吸的关键酶，延胡索酸作为最终电子受体。革兰氏阴性菌及多数兼性厌氧革兰氏阳性菌，都具有这种特性。并且在一些绿藻、原生动物、寄生蠕虫和低等海洋生物等真核生物的新陈代谢过程中，具有重要作用。该酶催化的延胡索酸还原反应和琥珀酸脱氢酶催化的琥珀酸氧化反应互为逆反应，后者主要存在于有氧呼吸中，是TCA(三羧酸循环)循环中的关键酶之一。对于延胡索酸还原酶，目前在模式生物大肠杆菌中的研究比较透彻。这种结构的酶含有3到4个亚单位A、B、C、D。其中亲水性的Frd-A和Frd-B亚基形成酶催化域，I到2个小的疏水亚基形成膜锚定结构。从大肠杆菌中分离得到的延胡索酸还原酶是一种醌醇类膜结合型蛋白，具有4个亚基，并与Frd辅基共价结合。与琥珀酸脱氢酶(SDH)即复合体11具有较高的同源性。但是两酶的表达条件有所不同，Frd是在缺氧条件下表达，而SDH则是在有氧条件下表达。Frd由frd(AB⑶)操纵子编码，表达4个不同的多肽。其中frdA基因编码66kDa的FAD亚基复合体，而frdB基因则编码27kDa的铁硫簇亚基复合体，这两个亚基组成大肠杆菌的催化域，并通过frd⑶编码的Frd-C和Frd-D亚基结合于大肠杆菌内膜上。目前已发现延胡索酸还原酶主要可分为两类膜结合型和可溶型。大多数的延胡索酸还原酶属于膜结合型，含有3-4个亚基，即一个催化亚基，一个铁簇蛋白亚基，以及1-2个将催化亚基和铁簇蛋白亚基结合于膜上的锚定亚基。催化亚基含有活性位点，而铁簇蛋白亚基则通过锚定亚基将电子传递给催化亚基。此类型的延胡索酸还原酶主要是在厌氧条件以及维持氧还平衡时才起还原延胡索酸生成琥珀酸的功能。而第二种类型的延胡索酸还原酶是可溶型的独立酶，与膜结合型酶的催化亚基具有同源性。目前已知的具有此种类型酶的生物还很少。不同微生物中延胡索酸还原酶的产生条件及所需辅酶都有所不同，或以NADH为辅酶，或以FAD为辅酶；辅酶与酶蛋白的结合方式也有差别，可共价结合，也可非共价结合;而在酶反应过程中，电子传递中的供受体也有区别，有以泛醌，也有以甲基萘醌。当今有关延胡索酸还原酶的研究，均是直接从菌体分离获得，之后再进行酶的特性研究，是所研究微生物自身含有的基因。诸如Cesar Luna-Chavez等人从厌氧培养的大肠杆菌膜碎片中提取到延胡索酸还原酶粗酶液，然后通过离子交换柱、灌柱、过滤等方法纯化酶，得到了高活性的纯酶液，最后利用非离子去污剂得到了棕黑色的延胡索酸还原酶结晶。但该酶并非微生物正常代谢过程中的必须酶，只有在外界条件改变时才会产生，因此在实际生产时，对外界条件有很高的要求，不利于大规模的生产应用。研究来自于未培养微生物、编码延胡索酸还原酶新基因，不仅可以研发新的生物生产工艺提高琥珀酸产量，也可以为构建高产琥珀酸的基因工程菌提供新的理论参考模式和依据。目前国内外还鲜见有关未培养微生物延胡索酸还原酶新基因的研究。因此，利用宏基因组学技术，研究极端环境体系未培养微生物和克隆未培养微生物酶基因，分离筛选新型延胡索酸还原酶基因，在理论上及在实际应用中都具有特别重要的研究意义
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种编码延胡索酸还原酶的基因及其应用，通过构建来自于广西北部湾海洋环境沉积物宏基因组文库，采用酶的直接测序筛选策略，从基因文库里面分离得到了编码延胡索酸还原酶的新基因，可在宿主细胞中大量表达该基因以生产琥珀酸，对于研发新的生物工艺大量生产琥珀酸具有重要的意义和广泛的用途。本专利技术所提供的一种编码延胡索酸还原酶的基因，名称为frdlA，来源于广西北部湾海洋环境体系未培养微生物，具有下列核苷酸序列之一I) 一种编码延胡索酸还原酶的基因frdlA，其核苷酸序列为序列表No.1所示。2)所述基因编码的蛋白质，其氣基酸序列如序列表No. 2所不。序列表No. 2所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有延胡索酸还原酶活性的蛋白质。携带该基因的质粒大肠埃希氏菌Escherichia coli已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC No. 5936，保存日期为2012年3月27日，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号。序列表No.1的DNA是克隆重组质粒pGXAR313所含的外源DNA片段中携带的完整开放阅读框架(ORF，Open Reading Frame)，该ORF由444个碱基组成，GC含量为49. 67%。为一个可能完整的新型延胡索酸还原酶基因，新基因被命名为frdlA。从5’端第I个核苷酸开始起始密码子ATG到444个碱基以终止密码子TAG结束，为一个完整的0RF，自5’端的第1-3位核苷酸为frdlA基因的起始密码子ATG，自5’端的第442-444位核苷酸为frdlA基因的终止密码子TAG。该ORF—共444个核苷酸可编码由147个氨基酸组成的蛋白。通过Blastx分析该氨基酸序列和来自于菌株“Runella slithyformis DSM 19594”的一个“Succinate dehydrogenase/fumarate reductase iron-sulfur subunit，，基因存在 82%的相似性，69 %的一致性。本专利技术提供的一种编码延胡索酸还原酶的基因的克隆方法包括下列步骤( I)从广西北部湾海洋环境样品中提取未培养微生物宏基因组DNA，构建海洋环境宏基因组文库；(2)基于序列特异性的筛选策略，从海洋环境宏基因组文库中分离含有延胡索酸还原酶的克隆。本专利技术提供的编码延胡索酸还原酶的新基因，可在宿主细胞中大量表达该基因以生产延胡索酸还原酶，从而构建新的生物工艺进行琥珀酸的生产，在构建新的生物工艺生产琥珀酸等方面具有广泛的用途。附图说明图1为从广西北部湾海洋环境样品中提取的未培养微生物的宏基因组DNA。图2为广西北部湾海洋环境宏基因文库克隆的限制性内切酶EcoRI酶切分析以判断文库质量。图3为原始克隆PGXAR313的酶切检测结果。图4为frdlA基因DNA序列以及编码产物分析图。图5为重组表达克隆E. coli Tuner (DE3)pLacI/pGXAR313G的构建检测分析。 图6为携带frdlA基因的重组质粒pGXAR313G的DNA转化大肠杆菌E. coliTuner(DE3)pLacI后得到的重组表达克隆的蛋白的SDS-PAGE分析结果。图7为延胡索酸在FrdlA重组蛋白作用下的产物分析结果。图8为不同温度对FrdlA重组蛋白的酶活影响。图9为不同pH值对FrdlA重组蛋白的酶活影响。具体实施例本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种编码延胡索酸还原酶的基因frd1A，其特征在于，其核苷酸序列为序列表No.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋承建，吴兰兰，唐咸来，申佩弘，武波，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：
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