一种海参体壁总DNA提取方法技术

本发明专利技术公开了一种海参体壁总DNA提取方法。它包括样品预处理、样品的裂解、样品消化液用氯仿：异戊醇抽提，含有DNA的水相加入等体积的异丙醇高盐溶液，-20℃下放置20min，12000-13000g/min离心12-15min，弃上清，取DNA沉淀；所述的异丙醇高盐溶液是由异丙醇和5mol/L?NaCl按体积比3：1混合而成；用体积分数70%乙醇水溶液的洗涤DNA沉淀，然后12000-13000g/min离心3-5min，弃上清；重复操作2-3次，将DNA沉淀干燥，再用0.1×TE溶液充分溶解保存。因此利用本发明专利技术的海参体壁总DNA提取方法能够高质量的提取到海参DNA，其DNA纯度高，避免了粘多糖、胶原蛋白和色素等影响，能满足后续PCR等分子生物学实验的要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种海参体壁总DNA提取方法。
技术介绍
海参体壁中含有丰富的胶原、黏多糖和多种微量元素，具有较高的营养价值和药用价值。在我国被认为是传统的美味和滋补品。全球可供食的海参种类约50多种，作为名贵的海产品，市场上海参通常加工为干品或冻品出售，海参经过多道工序加工成干品后，很难从外部形体上分辨出其种类。目前在市面上销售的海参产品，大多根据其颜色和产地来命名贴标，如“美国红参”、“非洲海参”等，缺乏规范的商品命名，海参市场贴标混乱。 根据海参线粒体DNA片段如COI和16S rDNA序列,可以从分子水平鉴定海参种类和开发出简便的种类鉴别方法。由于海参含有丰富的黏多糖和蛋白质，造成DNA的提取比较困难，尤其是高质量DNA的获得，DNA中多糖等杂质过多会影响后续PCR扩增等分子生物学实验，进而影响了海参种类的分子鉴定。另外，干海参经过加工处理，其核基因组DNA已降解，与核基因组DNA相比，线粒体DNA结构简单、稳定，拷贝数多，可以用于海参种类的分子鉴定。
技术实现思路
本专利技术的目的是为解决现有技术中存在的上述问题，提供一种能对海参酒精保存样品和干品均适用的海参体壁总DNA提取方法，该方法提取的DNA纯度高，避免了粘多糖、胶原蛋白和色素等影响，能满足后续PCR等分子生物学实验的要求。本专利技术的海参体壁总DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤(a)样品预处理第一步是将海参的酒精保存样品用PBS溶液置换出酒精，或将海参干品用PBS溶液浸发，将第一步处理好的样品在高盐缓冲液中剪碎样品，然后固液分离，弃液相取剪碎的固体样品作为预处理后的样品；所述的高盐缓冲液为200mmol/LTris-HCl, 50mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, O. 2% β -巯基乙醇，余量为水，pH 8. O ；(b)样品的裂解将预处理后的样品加入到裂解液中，再加入适量的蛋白酶K降解蛋白质，65 消化3(T60min,每隔5 IOmin混勻一次,待样品消化彻底后，12000g/min离心2 3min，上层形成一层悬浮粘稠物，取下层澄清的样品消化液；所述的裂解液为IOOmmol/LTris-HCl, 20mmol/L EDTA,1. 4mol/L NaCl,2%CTAB, 1%PVP, 1%SDS,0. 2%β -巯基乙醇，余量为水；(C)样品消化液用氯仿异戊醇抽提，含有DNA的水相加入等体积的异丙醇高盐溶液，-20°C下放置20min，12000-13000g/min离心12_15min，弃上清，取DNA沉淀；所述的异丙醇高盐溶液是由异丙醇和5mol/L NaCl按体积比3 1混合而成；(d)用体积分数70%乙醇水溶液的洗涤DNA沉淀，然后12000-13000g/min离心3-5min,弃上清；重复操作2_3次，将DNA沉淀干燥，再用O.1 X TE溶液充分溶解保存。所述的步骤(a)的将海参的酒精保存样品用PBS溶液置换出酒精优选为取海参的酒精保存样品在PBS溶液中放置3-6min，期间更换PBS溶液2次；所述的步骤(a)的将海参干品用PBS溶液浸发是将海参干品在PBS溶液放置30-60min，期间更换PBS溶液2次；所述的步骤(a)的固液分离是在10000-12000g/min离心l_2min,弃上清液；重复操作2次。所述的步骤(C)的样品消化液用氯仿异戊醇抽提优选为样品消化液中加入等体积的体积比为24:1的氯仿异戍醇中，充分混勻，静止l_2min, 12000-13000g/min离心12-15min，取上清液；重复操作2_3次。本专利技术中的PBS溶液是现有技术中的产品，其为137mmol/L NaCl,2. 7mmol/L KCl,IOmmoI/L Na2HP04，2mmol/L KH2PO4,余量为水，ρΗ7· 2。本专利技术与现有技术相比，具有如下优点(I)使用PBS置换出酒精保存样品中酒精和浸发干海参样品，可提高提取DNA的获·得量；(2)在高盐缓冲液中剪碎组织样品，可除去样品中胞外多糖和色素等，降低它们对提取DNA的影响；(3)样品裂解液为添加SDS的CTAB抽提缓冲液，即可快速的裂解组织，又有利于去除多糖；(4)异丙醇高盐溶液沉淀DNA，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，消除多糖对DNA质量的影响；因此利用本专利技术的海参体壁总DNA提取方法能够高质量的提取到海参DNA，其DNA纯度高，避免了粘多糖、胶原蛋白和色素等影响，能满足后续PCR等分子生物学实验的要求。附图说明图1是本专利技术的实施例1和3提取并纯化出的海参体壁总DNA琼脂糖电泳图。M :DNA Marker(DL15000), 1-4 :花刺参酒精保存样品提取的DNA，5_8 :墨西哥刺参干品提取的DNA。图2是以本专利技术的实施例1和3提取DNA为模板COI扩增产物的琼脂糖电泳图。M DNA Marker (DL2000)，1-4 :花刺参酒精保存样品提取DNA为模板的COI扩增产物，5-8 墨西哥刺参干品提取DNA为模板的COI扩增产物。具体实施例方式以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例1:(I)样品预处理材料为花刺参(Stichopus monotuberculatus)酒精保存样品，用剪刀取样品40mg，放入 L 5ml 离心管中，加入 800μ I PBS 溶液(137mmol/L NaCl, 2. 7mmol/L KCl，IOmmoI/LNa2HPO4, 2mmol/L KH2PO4,余量为水，pH 7. 2)，放置 3min，期间更换 PBS 溶液 2 次，得到处理后的样品。随后剪取处理后的样品60mg，放入1. 5ml离心管中，加入1000 μ I高盐缓冲液中(200mmol/L Tris-HCl, 50mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 0. 2%β-巯基乙醇，余量为水，pH 8. O，％指的是质量体积分数)，充分剪碎样品，12000g/min离心lmin，弃上清液；重复操作2次，取沉淀，得到的沉淀即为预处理后的样品。(2)样品裂解样品裂解液为添加了 SDS的CTAB抽提缓冲液(100mmol/L Tris-HCl, 20mmol/LEDTA,1. 4mol/L NaCl，2%CTAB，1%PVP, 1%SDS,0. 2%β -巯基乙醇，余量为水，% 指的是质量体积分数)，加热至65°C，混匀；向预处理后的样品中加入800 μ I预热的裂解液和20 μ I20mg/ml蛋白酶K，放置在65°C金属浴上，消化40min，每5min混匀一次。待样品消化彻底后，12000g/min离心2min，上层将形成一层悬浮粘稠物，用移液器吸取下层澄清的样品消化液，转入新的离心管中。(3)氯仿异戊醇抽提向样品消化液中加入等体积的氯仿异戊醇(体积比24:1 )，充分混匀，静止lmin，12000g/min离心15min，用粗口枪头移液器轻吸上清，转入新的离心管；重复操作2次，得上清液。(4)异丙醇高盐沉淀DNA向上清液中加入等体积异丙醇高盐溶液(异丙醇和5mol/L NaCl按体积比3 1混合而成)，混勻，_20°C下放置20min ;12000g/min本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海参体壁总DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：（a）样品预处理：第一步是将海参的酒精保存样品用PBS溶液置换出酒精，或将海参干品用PBS溶液浸发，将第一步处理好的样品在高盐缓冲液中剪碎样品，然后固液分离，弃液相取剪碎的固体样品作为预处理后的样品；所述的高盐缓冲液为：200mmol/L?Tris?HCl,50mmol/L?EDTA,500mmol/L?NaCl,0.2%β?巯基乙醇，余量为水，pH8.0；（b）样品的裂解：将预处理后的样品加入到裂解液中，再加入适量的蛋白酶K降解蛋白质，65℃消化30~60min，每隔5~10min混匀一次，待样品消化彻底后，12000g/min离心2~3min，上层形成一层悬浮粘稠物，取下层澄清的样品消化液；所述的裂解液为100mmol/LTris?HCl，20mmol/L?EDTA，1.4mol/L?NaCl，2%CTAB，1%PVP，1%SDS，0.2%β?巯基乙醇，余量为水；（c）样品消化液用氯仿：异戊醇抽提，含有DNA的水相加入等体积的异丙醇高盐溶液，?20℃下放置20min，12000?13000g/min离心12?15min，弃上清，取DNA沉淀；所述的异丙醇高盐溶液是由异丙醇和5mol/L?NaCl按体积比3：1混合而成；（d）用体积分数70%乙醇水溶液的洗涤DNA沉淀，然后12000?13000g/min离心3?5min，弃上清；重复操作2?3次，将DNA沉淀干燥，再用0.1×TE溶液充分溶解保存。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：夏建军，胡超群，张吕平，王艳红，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：