本发明专利技术的目的是提供一种内切葡聚糖酶，即从玉米细菌性枯萎病菌中分离的内切葡聚糖酶基因，其氨基酸序列为SEQ?ID?NO：1。本发明专利技术筛选的内切葡聚糖酶用于制备单克隆抗体。本发明专利技术克隆得到了玉米细菌性枯萎病菌细胞壁降解酶基因及其编码的氨基酸序列，对明确该病的病理生理学特征及致病机理提供了重要理论依据，将该基因序列克隆到大肠埃希菌中表达，表达的蛋白则可以快速地用于制备特异性单克隆抗体，可作为口岸检疫过程中快速检测玉米细菌性枯萎病菌的一种高效手段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于海洋微生物基因克隆
，具体涉及一种内切葡聚糖酶，即一种从玉米细菌性枯萎病菌中分离的内切葡聚糖酶基因。
技术介绍
玉米细菌性枯萎病(Pantoea stewartii subsp. stewartii)最早发生于美国，后来扩散到欧洲、大洋洲等地。目前已知发生地区有北美、中美、秘鲁、前苏联等。病菌通过病种子进行远距离传播，病区通过玉米叶甲和杂草寄主传播并越冬。玉米细菌性枯萎病是维管束型病害，受害后植株矮缩或枯萎，对玉米特别是甜玉米能造成极大危害。研究发现宿主内切葡聚糖酶在玉米细菌性枯萎病菌的毒力及吸附上起着重要的作用。由玉米细菌性枯萎病菌的内切葡聚糖酶基因编码的胞壁降解酶首先通过消化宿主木质的基膜来帮助其吸附 到宿主中，然后通过消化宿主中木质部分的丰富碳源等营养物质来提高自身的运动能力，因此内切葡聚糖酶对于玉米细菌性枯萎病菌的毒力是十分重要的。有必要获得玉米细菌性枯萎病菌的内切葡聚糖酶的不同的等位基因，从而对其序列和功能进行更详细的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种内切葡聚糖酶，即从玉米细菌性枯萎病菌中分离的内切葡聚糖酶基因，从而弥补现有技术的不足。本专利技术筛选的内切葡聚糖酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO :1。本专利技术的内切葡聚糖酶，是从玉米细菌性枯萎病菌中分离的。用于编码上述内切葡聚糖酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO :2。本专利技术筛选的内切葡聚糖酶用于制备单克隆抗体。本专利技术克隆得到了玉米细菌性枯萎病菌内切葡聚糖酶基因及其编码的氨基酸序列，对明确该病的病理生理学特征及致病机理提供了重要理论依据，将该基因序列克隆到大肠埃希菌中表达，表达的蛋白则可以快速地用于制备特异性单克隆抗体，可作为口岸检疫过程中快速检测玉米细菌性枯萎病菌的一种高效手段。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术筛选的内切葡聚糖酶进行详细描述。一、玉米细菌性枯萎病菌内切葡聚糖酶基因的克隆1、玉米细菌性枯萎病菌内切葡聚糖酶基因基因组DNA的提取方法参照Adams等的方法(Adams et al. , 1998)。所述玉米细菌性枯萎病菌作为内切葡聚糖酶基因的供体。菌株玉米细菌性枯萎病菌购自于美国典型菌种保藏中心(ATCC)，保藏号为81992、简并引物的设计根据不同种属内切葡聚糖酶基因的保守序列以及玉米细菌性枯萎病菌偏好性设计简并引物Fl，Rl Fl 5， - GGNTGGTAYGAYGCNGG-3’Rl 5’ - AANGTNGGRTCDATRTT-3’上述简并引物F1，R1是在克隆玉米细菌性枯萎病菌的基因序列时采用的。结合细菌密码子的使用频率，去除使用频率较低的密码子，最终确定引物Fl，Rl03、内切葡聚糖酶基因片段的PCR扩增 反应体系(50μ L) IOx缓冲液5.0 μ—L dNTPs (2.5 mM)4.0 |iLF1 (SOmM)1,0 μ[Rl (50mM)1.0 nL 丁aq DNA 聚合痛—1.0 μ 基因组DNA2.0 iih H2O36.0 \ih反应条件预变性94 °C，5min ;变性温度94 °C, Imin ;退火温度49°C, Imin ;延伸温度72 ° C，I min ;30个循环后，72 0C延伸IOmin0其中所述基因组DNA为内切葡聚糖酶基因组DNA。将设计好的简并引物按上述的方法进行PCR扩增，获得了大小为381bp的一条目的片段。4、PCR产物的回收将上述的PCR产物加入琼脂糖凝胶上样孔中，电压50V，电泳20min，在紫外灯下切下目标带，用凝胶回收试剂盒(购自TaKaRa, Japan)回收。5、PCR产物与PMD19-T载体连接将回收PCR产物与pMD19-T载体连接。连接体系(ΙΟμυ: 冋收PCR hi的产物I 3μ[ 溶液〖(.含连接酶)5 |iL PMD19-T载体(购于丁aKaRa公爾，大连)I |iL H2O补至 I OpL 160C迮接丨 2h =6、阳性克隆的筛选根据α互补现象，用X-gal对克隆进行初步筛选。蓝色菌落为阴性菌落，白色菌落为阳性菌落。用无菌牙签挑取白斑克隆转接于LB液体培养基溶液中，提取质粒并测序；所述LB液体培养基(g/L):胰蛋白胨10. 0，酵母粉5. 0，氯化钠10. 0，pH7. 2到7. 5，121°C，20min 灭菌。将扩增得到的片段切胶回收，回收片段与克隆载体PMD19-T连接，转化到大肠杆菌(DH5ci )感受态细胞中，过夜培养，提取质粒并进行测序，最终确认得到了 381bp的核苷酸序列(SEQ ID NO: 3)。根据所获得碱基序列利用分子生物学软件(primer 5. O)直接推测得到该基因片段所编码的氨基酸序列(SEQ ID N0:4)。7、cDNA末端快速扩增(RACE)方法扩增脂肪酶基因全长I)根据上述6测序结果设计合成寡聚核苷酸引物GSPl和GSP2。 Gsp2 5， - AGGTAGGATCAATATTTTTAAACAT -3，Gspl 5’ - GGTATGATGCAGGTGATAAAGGAAA -3’2)根据已知上述6测序结果在合成的引物GSPl和引物GSP2内侧分别设计巢试引物NGSPl和引物NGSP2。Ngsp2 5， - TGCTAATATAGCTGCGGCACATGCA -3，Ngspl 5， - ATAAATAACGGTGCCTTAGCTGTAT -3，3) 5，-CDS引物与3’-CDS引物为试剂盒自带。反转录合成第一链cDNA5,-RACE- cDNAS'-RACE- cDNA3.0pL RNA 样品3 μ RNA Wm-1.0pL5’-CDS 引物lpL3MDS 引物1.0pL寡聚TΙμ—L双蒸水轻微离心并混合均匀，70 ° C孵育2min，置冰上冷却2 min,混合均匀。上述首先按照RACE方法引物设计要求，根据已经扩增出的内切葡聚糖酶基因片段，分别设计上下游引物Gsp I，Gsp2。以玉米细菌性枯萎病菌RNA为模板，合成cDNA第一链，然后反转录合成第二链，接下来分别以Gspl，Gsp2作为引物进行首轮PCR。再选取靠近GSP引物并且位于其内侧的的碱基序列作为模板设计巢试引物NGSP。将首轮扩增的5’-RACE与3’-RACE产物稀释50倍，分别作为第二轮巢试引物扩增的模板进行PCR扩增。使用巢试引物进行PCR扩增后，分别得到了大小为1468bp (5’RACE产物)与 840bp (3’RACE产物)左右的两组产物，将得到的核酸序列进行DNA序列测定并进行序列拼接。拼接后最终得到一条大小为1977bp的内切葡聚糖酶LYega的核苷酸序列(SEQ ID N0:2),编码658个氨基酸(SEQ ID NO:1),即为玉米细菌性枯萎病菌内切葡聚糖酶基因序列。通过在获得的SEQ ID NO: 2的两端设计引物进行全长扩增，结果表明没有发生拼接的错误。二、玉米细菌性枯萎病菌内切葡聚糖酶基因在大肠中的表达①pET-LYega 表达载体的构建根据已述已克隆的内切葡聚糖酶序列，添加酶切位点，设计表达引物如下F3 5， -GACGAATTC ATGAAAAACAA -3，F4 5’ -AACGCGGCCGC GAAGCTATTA3’下划线标注的为Ec本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种内切葡聚糖酶，所述的内切葡聚糖酶的氨基酸序列为SEQ?ID?NO：1。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：厉艳，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：
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