一株空间肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株制造技术

本发明专利技术涉及一株太空环境下肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株的生物学特性、基因组DNA序列、转录组和差异蛋白组学，特别是同地面肺炎克雷伯氏菌比较分析鉴定出的功能序列和分子在阐明空间环境对微生物的作用及用途，可获得全面、准确的空间诱变肺炎克雷伯氏菌菌株突变的基因、差异表达基因和蛋白质。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
；更具体地，本专利技术涉及太空环境下肺炎克雷伯氏菌的生物学特性、全基因组测序信息、转录组测序以及差异蛋白组学分析。
技术介绍
随着人类不断进行太空探索，太空成为人类活动的新领域，而空间环境十分复杂，如微重力、宇宙辐射、极端温度等，这些因素对空间驻留人员体内及空间站中的细菌生物学性状及致病性都会产生影响，在空间站中已检测出肺炎克雷伯氏菌等多种细菌，空间环境对微生物的作用和机制研究是迫切需要关注的前沿问题。克雷伯氏菌是革兰氏阴性杆菌，是一种无动力菌，属于肠杆菌属兼性厌氧菌，包括鼻硬结亚种、鼻炎亚种和肺炎亚种等三个亚种。其中克雷伯氏菌鼻硬结亚种，主要侵犯鼻咽·部，常导致慢性肉芽肿性病变，故又称鼻硬结杆菌；臭鼻亚种，主要引起慢性萎缩性鼻炎，有恶臭，因此被称为又称臭鼻杆菌；肺炎亚种，即肺炎杆菌，常存在于人体上呼吸道和肠道中。肺炎克雷伯氏菌是一种无处不在的条件致病菌，寄生在人类的粘膜表面，对人致病性较强，并导致严重的疾病，如败血症，肺炎，尿路感染，软组织感染。近年来随着临床上广谱抗菌药物的大量应用，其检出率和耐药率呈上升趋势。随着科学技术的不断发展，近年来的基因组、转录组、蛋白组等组学的研究越来越多，也是揭示各种生命现象和病理生理过程发生的分子机理的较好切入点。通过基因组、转录组测序和蛋白组等方法系统地分析太空环境导致细菌发生变化的机理，研究空间环境对肺炎克雷伯氏菌的作用和机理，有利于了解天空环境下细菌致病性发生变化的机理，以及通过研究空间环境下细菌发生的改变，为地面上难治性感染的研究提供新的启示。
技术实现思路
本专利技术的一个目的提供空间环境诱变的肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株本专利技术提供的该菌株，其保藏号为CGMCC NO. 6521。—株肺炎克雷伯氏菌，其特征包括革兰氏染色阴性，呈单个、短杆状；同地面对照株的抗生素耐受性相比，无明显变化；无生长速度的差异；Biolog反应板上醋竹桃霉素(_)、二甲胺四环素(_)、洁霉素(_)、盐酸胍(_)、硫酸四癸钠(_)、万古霉素(_)、四唑紫(_)、四唑蓝(_)、梭链孢酸(_)。所述的肺炎克雷伯氏菌，利用全基因组测序和比较基因组学分析获得基因突变，见表1，空间环境导致LCT-KP182基因组上SNP的变化，包括SNP在基因组上的位置，突变位点及编码蛋白以及注释出的基因。表1:空间环境导致LCT-KP182基因组上SNP的变化SNP位置突变碱基参考基因ID 注释库ID突变蛋白scaffold 1_548898C-AUUWGL000650gi|152973077G-Gscaffold4_916275G-TUUWGL001928gi|238896298G-Vscaffold8_1119951G —TUUWGL004713 tr|C4X7G8P-Qscaffold8_1119952G —AUUWGL004713 tr|C4X7G8P^Sscaffold9_841241G-TUUWGL005614 tr|G0GS85G-V scaffold9_913353C-AUUWGL005686 tr|G0GT30P-Tscaffold9_913358C —AUUWGL005686 tr|G0GT30S —S所述的肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株，进行转录组测序鉴定差异表达基因(FDR ( 0. 001 和 I log2Ratio| 彡 2)见附表 I。所述的肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株，进行差异蛋白组学分析鉴定的差异表达蛋白(蛋白丰度差异倍数超过2倍以上时；经统计检验其p-val ue值小于0.05;三次重复中至少两次重复中达到上述要求)见附表2。附图说明图1肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株革兰氏染色图2肺炎克雷伯氏菌LCT-KP18 2菌株生理生化鉴定图3肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株生长曲线图4肺炎克雷伯氏菌LCT-KP214菌株生长曲线图5肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株溶血情况图6LCT-KP182菌株的GC含量与Depth关联分析7LCT-KP182菌株和地面对照组LCT-KP214的二维共线性8LCT-KP182菌株的转录组测序基因覆盖度9转录组测序鉴定的差异表达基因图10差异蛋白组学鉴定的差异表达蛋白质附件说明附件1LCT-KP182菌株转录组测序分析的差异表达基因信息附件2LCT-KP182菌株定量蛋白组学分析的差异表达蛋白信息具体实施例方式下述实施实例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施实例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施实例一肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株的革兰氏染色取50ul样品离心，弃上清，加入无菌水50ul，吸取20ul于载玻片上进行固定；初染，吸取革兰氏染色I (结晶紫)2滴于载玻片样品上进行初染lmin，然后用自来水冲洗染液；媒染，吸取革兰氏染色II (碘液)2滴覆盖涂面染约lmin，然后用自来水冲洗染液，用吸水纸吸取涂面上的水分；脱色，吸取革兰氏染色III (酒精)2滴滴在涂面上约30s，用水冲洗载玻片，用吸水纸吸取涂面上的水分；复染，吸取革兰氏染色IV(番红)2滴滴在涂面上约lmin，用水冲洗载玻片，用吸水纸吸取涂面上的水分；观察，先用显微镜低倍镜找到目标视野，然后再用油镜(IOOX)进行观察，判定并记录结果、拍照，见图1，从图中可看出LCT-KP182菌株革兰氏染色阴性，呈单个、短杆状。实施实例二 肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株的抗生素敏感性检测配制LB固体培养基25L，灭完菌后倒1500个平板，晾干，备用；菌悬液的制备，取出这些单菌的斜面，并准备盛有Iml无菌生理盐水的1. 5ml离心管，用灭菌的竹签从斜面上蘸取适量菌种于1. 5ml离心管中，混匀，调菌浓度约107 108 ;稀释涂布，吸取备好的菌悬液100 μ I进行涂布，尽可能地涂布均匀，每株单菌涂6个平板，每涂完一株菌，就进行下一步(粘贴药敏片)；粘贴药敏片，选择抗生素进行药敏试验，以筛选出抗药性突变的菌株；贴完药敏片后，将平板放置在37°C下培养18 24h ;观察结果，将平板培养18 24h，取出观察平板上药敏片的抑菌情况，并记录抑菌圈的大小(直径cm)，其中药敏片直径约为O. 6cm。肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182同地面对照LCT-KP214菌株相比，其抑菌圈无明显变化。实施实例三肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株的生理生化鉴定实验菌悬液制备，取出菌株的斜面，用灭菌竹签蘸取菌种接种在LB液体培养基中(4ml体系)，培养24h。然后取2ml菌液6000r/s离心5min，弃上清培养基，留下离心的菌体，然后用灭菌的生理盐水洗涤菌体，6000r/s离心5min，再次弃去上清，再用Biolog接种液进行悬浮菌体，最后再转至15ml的接种液中。调至浓度约IO7 IO8 ;接种，将以上菌悬液倒至接种皿中，震荡均匀，用12道(或8道)排枪进行加样，每个Biolog板孔加样IOOul，共96孔，加完样后，盖上Biolog板盖,放置在37°C下培养，24h和48h进行观察，并记录结果,见图2和表2，可看出醋竹桃霉素(_)、二甲胺四环素(_)、洁霉素(_)、盐酸胍(_)、硫酸四癸钠(_)、万古本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肺炎克雷伯氏菌LCT?KP182，其保藏号为：CGMCC?NO.6521。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘长庭，郭英华，方向群，王俊峰，李天志，常德，苏龙翔，王雅娟，陈振鸿，郭娜，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：