本发明专利技术公开了一种内切褐藻胶裂解酶Alg2A的基因序列及其制备方法与应用。本发明专利技术所涉及的褐藻胶裂解酶Alg2A来源土壤新分离菌株Flavobacterium?sp.S20。本发明专利技术还提供了一种制备该新型褐藻胶裂解酶的方法，即利用基因工程的技术方法，将该新褐藻胶裂解酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，用该菌株异源表达制备的褐藻胶裂解酶Alg2A，具有降解褐藻酸钠制备褐藻酸钠寡糖的功能。本发明专利技术提供的褐藻胶裂解酶Alg2A可广泛应用于化工、农业、食品、饲料添加、医药及海藻遗传工程等领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种内切褐藻胶裂解酶Alg2A的基因序列及其制备方法和应用。本专利技术还提供了该内切褐藻胶裂解酶的重组质粒和重组基因工程菌株。本专利技术的内切褐藻胶裂解酶Alg2A可广泛应用于化工、农业、食品、饲料添加、医药及海藻遗传工程等领域。
技术介绍
广阔的海洋蕴藏着丰富的海藻资源，而其中主要由蓝藻、绿藻、红藻和褐藻四大类组成。褐藻胶(algin)是一种直链酸性多糖，在天然状态下，褐藻胶在褐藻细胞壁中主要的存在形式为水溶性褐藻酸钠(sodium alginate)、钾等碱金属盐类和水不溶性褐藻酸 (alginic acid)及其与2价以上金属离子结合的褐藻酸盐类(alginates)。目前市场上的褐藻酸钠(商品名为海藻酸钠)或其他褐藻酸盐主要是从褐藻中获得。研究发现降解褐藻酸钠所得到的寡糖具有多种生物活性，比如免疫调节、促生长、诱导植物抗性和提高蛋白质稳定性等，因而可广泛应用于化工、农业、食品、饲料添加和医药等领域(窦勇，广西轻工业，2009，10 :12-13)。褐藻酸钠可用多种方法降解，包括化学降解法、物理降解法和酶降解法。化学降解法以酸降解为主，但该方法降解条件难以控制，操作较复杂，耗时长。物理降解法包括辐射法和超声法等，一般与其他降解法一起使用，降解产物的极限分子质量为50ku左右，不易制得寡糖。而用褐藻胶裂解酶降解褐藻酸钠具有降解条件温和，得率高等优点，且因为酶的底物专一性，能为后续研究寡糖化学结构提供信息，故而褐藻胶裂解酶逐步成为优先降解褐藻酸钠的方法。另外，褐藻胶裂解酶还能应用于肺囊肿性纤维化症的治疗、海藻饲料加工及海藻遗传工程等领域的研究(Wong TY et a1. Annual Review of Microbiology,2000,54 :289-340)。褐藻酸裂解酶来源于海洋动植物和多种微生物(包括海洋细菌、土壤细菌和真菌)。褐藻酸钠裂解酶按其底物专一性可分为两大类1，4-β -D-甘露糖醛酸片段裂解酶(Ec 4. 2. 2. 3)和l，4-a-L-古罗糖醛酸片段裂解酶(EC 4. 2. 2. 11) 0至今，褐藻 胶裂解酶的生产大多依赖原始产酶动植物或微生物来获得酶蛋白，此种方法虽然能有效的获得一定量的酶蛋白，但产量有限，成本较高，较难满足实际应用需求。随着生物技术的发展， 提供了利用基因工程高效生产褐藻胶裂解酶的技术方法。Dong Eun Kim等根据已知的相关功能基因的相似序列设计PCR引物，从Streptomyces sp. ALG-5菌株中克隆到了一个褐藻胶裂解酶基因，并在Escherichia coli BL21 (DE3)中成功表达(Kim et al. Marine Biotechnology. 2009. 11 :10-16)。采用这一策略必须对相关基因序列有一定的了解才能设计PCR引物，并且找到的是某一类结构或功能相似蛋白质中的新分子，较难发现全新的基因。将产酶菌株构建其基因组文库，可以突破PCR克隆基因的限制，充分挖掘和利用微生物的基因资源，再结合功能筛选的方法，能够发现全新的基因。Caswell等从 Klebsiella pneumoniae PGl菌株的基因组文库中克隆到对聚古罗糖醒酸片段特异性降解的褐藻胶裂解酶基因，该酶的分子量为28kDa (Caswell et al. Gene, 1989, 75 :127-134)。Maki和Kraiwattanapong等人从Pseudomonas sp. 0S-ALG-9菌株的基因组文库中先后克隆到了两个褐藻胶裂解酶基因，一个是对聚甘露糖醛酸片段特异性降解的aly，该基因编石马区长 1365bp,编码了 398 个氨基酸,分子量约 50kDa (Maki et al. Journal of General Microbiology, 1993，139 :987-993)。另一个是 alyll,该基因编码区长 2141bp，编码了 713 个氨基酸，分子量约 79kDa (Kraiwattanapong et al. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 1997,61 (11) :1853-1857)。迄今为止，对于黄杆菌产褐藻胶裂解酶研究较少。Takeuchi等人用柱层析法从Flavobacterium multivolum K-11所产的粗酶液中纯化到了两种褐藻胶裂解酶，一种是分子量为43kDa的聚古罗糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.11) (Takeuchi et al. Food Science and Technology International. 1997. 3(1) 22-26)，另一种是分子量为32kDa，对聚古罗糖醛酸片段和聚甘露糖醛酸片段这两种片段底物降解速率相同的褐藻胶裂解酶(Takeuchi et al. Food Science and Technology International. 1997. 3 (4) :388-392)。An等人新分离到一株产褐藻胶裂解酶的 Flavobacterium sp. LXA菌株,他们从该菌株的发酵培养液中用硫酸铵沉淀法部分纯化了褐藻胶裂解酶，并将酶用于褐藻胶寡糖的生产及活性研究(An et al. Journal of Applied Microbiology. 2009. 106 :161-170)。目前来源于黄杆菌的褐藻胶裂解酶基因尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种产褐藻胶裂解酶的黄杆菌属新菌株，其为黄杆菌 S20，分类命名:黄杆菌 Flavobacterium sp.，保藏编号=CGMCC NO. 5026。本专利技术的第二个目的是提供一种新型高效的内切褐藻胶裂解酶Alg2A及其编码 基因。本专利技术的第三个目的是提供一种制备新型高效内切褐藻胶裂解酶Alg2A的方法。本专利技术的第四个目的是提供含有所述的内切褐藻胶裂解酶Alg2A基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。本专利技术的另一个目的是提供新型高效内切褐藻胶裂解酶Alg2A在褐藻酸钠降解中的应用。本专利技术所提供的内切褐藻胶裂解酶Alg2A，来源于土壤中分离纯化的黄杆菌属新菌株Flavobacterium sp. S20,其氨基酸序列具有如下特征之一I)序列表中的SEQ ID NO. 2从氨基端开始的第1_288或23-288位氨基酸残基序列，其中1-22位为信号肽，23-288位为有活性的褐藻胶裂解酶Alg2A的氨基酸。2)将序列表中的SEQ ID NO. 2从氨基端开始的第1_288或23_288位氨基酸残基序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加后具有降解褐藻酸钠活性的蛋白质。3)与序列表中的SEQ ID NO. 2所限定的氨基酸序列的同源性达到80%及以上且具有降解褐藻酸盐活性的蛋白质。本专利技术还提供了内切褐藻胶裂解酶Alg2A的编码基因(命名为alg2A)，具有下述核苷酸序列特征之一I)序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；2)编码序列表中SEQ ID NO. 2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；3)与SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80%及以上，且能本文档来自技高网...
【技术保护点】
黄杆菌属的菌株，其为黄杆菌S20，分类命名：黄杆菌Flavobacterium?sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC?NO.5026，保藏日期2011年07月05日。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杜昱光，黄李淑馨，李曙光，赵小明，曹海龙，刘航，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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