一种从梅花参中提取并纯化糖胺聚糖的方法技术

本发明专利技术属于生物技术天然活性物质提取领域，具体涉及一种从梅花参中提取并纯化糖胺聚糖的方法。其包括下列步骤：步骤一：梅花参预处理；步骤二：碱解梅花参体壁；步骤三：双酶酶解梅花参体壁；步骤四：酶解完毕后，用三氯乙酸去除双酶酶解液中的蛋白质；步骤五：用乙醇沉淀梅花参糖胺聚糖；步骤六：干燥梅花参糖胺聚糖粗糖；步骤七：双氧水脱色；步骤八：用纤维素离子交换柱层析法纯化梅花参糖胺聚糖；步骤九：用乙酸钾沉淀梅花参糖胺聚糖；步骤十：干燥梅花参糖胺聚糖精糖。本发明专利技术能够平衡梅花参糖胺聚糖得率与纯度的关系，提高梅花参糖胺聚糖的纯度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术天然活性物质提取领域，具体涉及。
技术介绍
慢性乙型肝炎是全球面临的一个严峻的健康问题，中国、东南亚及非洲是HBV感染的高发区，同时这些地区HBV相关性肝病如原发性肝癌的发生率也明显高于美洲中部和南部等HBV感染的低发区。慢性乙型肝炎治疗主要包括抗病毒、免疫调节、抗炎保肝、抗纤维化以及对症治疗，其中进行有效抗病毒治疗，持久抑制HBV DNA于PCR常规可检测范围以下是治疗的关键。硫酸多糖无论在体内还是在体外，都显示了不同程度的抗病毒、抗肿瘤和对免疫系统的调节作用。研究表明，硫酸多糖和其他聚阴离子物质可干扰反转录病毒及其 他病毒的吸附和侵入，有些表现出对各种反转录病毒的逆转录酶的抑制活性。硫酸多糖的抗病毒活性首先源于其聚阴离子特性，聚阴离子特性则主要源于其分子中的硫酸基。海洋是一个巨大的天然产物宝库，丰富的海洋生物和海洋活性物质为我们提供一个巨大的海洋药物资源库。特殊的海洋生态环境与生物链之间的密切相关性使得海洋生物次生代谢产物具有与陆生生物所不同的化学结构和特异高效的生物活性，因此对海洋生物多糖的开发应用具有重大意义。从海洋活性多糖中寻找治疗慢性乙型肝炎的有效药物，已引起国内外医药界的密切关注。现在的梅花参糖胺聚糖的提取方法主要包括碱裂解法、酶消化法以及乙醇沉淀法。但上述制备方法不能获得纯度高的梅花参糖胺聚糖，其主要原因是糖胺聚糖的化学结构有着显著的重叠性，如分子量差异法、硫酸化程度不一致、构想复杂、显微结构不均匀以及残基数量变化等，尤其在一个特定蛋白质聚糖分子上，其含有的糖胺聚糖链的种类、数量存在差异，使得现有的梅花参糖胺聚糖的制备方法很难获得纯度高的梅花参糖胺聚糖。
技术实现思路
为解决上述现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供，将梅花参糖胺聚糖用纤维素离子交换柱层析法纯化，得到纯度较高的梅花参糖胺聚糖。本专利技术的技术方案为，包括下列步骤步骤一梅花参预处理；步骤二 碱解梅花参体壁；步骤三双酶酶解梅花参体壁；步骤四酶解完毕后，用三氯乙酸去除双酶酶解液中的蛋白质；步骤五用乙醇沉淀梅花参糖胺聚糖；步骤六干燥梅花参糖胺聚糖粗糖；步骤七双氧水脱色；步骤八用纤维素离子交换柱层析法纯化梅花参糖胺聚糖；步骤九用乙酸钾沉淀梅花参糖胺聚糖；步骤十干燥梅花参糖胺聚糖精糖。优化的，所述步骤八的具体步骤为将50g 二乙氨基乙基纤维素用缓冲液浸泡过夜，脱气后装柱，用2倍柱床体积的缓冲液平衡；将30mg糖胺聚糖粗糖用IOmL缓冲液在40 60°C下溶解上柱，用缓冲液和1. 5mol/L的NaCl各150mL梯度洗脱，流速采用8mL/h，以3mL/管收集；用阿利新蓝比色法检测各管总糖胺聚糖的含量，收集有洗脱峰部分的样液，透析脱盐后，旋转蒸发器浓缩。优化的，所述缓冲液采用O. 5mol/L的NaAC，其pH为6. O 6. 5。本专利技术中所述DEAE-52纤维素为二乙氨基乙基纤维素，本专利技术对采用的试剂、材料和仪器没有特殊要求，其均为市售产品，可通过多种商业渠道购得。本专利技术的有益效果在于建立了一种有效地制备高纯度的梅花参糖胺聚糖的方法，在碱法提取的同时，结合胰蛋白酶和胃蛋白酶的双酶消化处理，即首先采用碱处理梅花参组织，再用胰蛋白酶和胃蛋白酶水解，以增强梅花参体壁组织汇总糖胺聚糖的释放。为提高糖胺聚糖的纯度，本专利技术采用纤维素离子交换柱层析法纯化梅花参糖胺聚糖粗糖。本专利技术的方法能够平衡梅花参糖胺聚糖的得率与纯度的关系，提高了梅花参糖胺聚糖的纯度。 具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明。实施例1 本实施例的从梅花参中提取糖胺聚糖的方法，包括下列步骤步骤一梅花参预处理；步骤二 碱解梅花参体壁；步骤三双酶酶解梅花参体壁；步骤四酶解完毕后，用三氯乙酸去除双酶酶解液中的蛋白质；步骤五用乙醇沉淀梅花参糖胺聚糖；步骤六干燥梅花参糖胺聚糖粗糖；步骤七双氧水脱色；步骤八用纤维素离子交换柱层析法纯化梅花参糖胺聚糖；步骤九用乙酸钾沉淀梅花参糖胺聚糖；步骤十干燥梅花参糖胺聚糖精糖。各步骤的具体方法为 步骤一梅花参预处理；迅速用蒸馏水冲洗梅花参，去除梅花参体表粘附的异物，用长形小刀自腹部仅肛门向前解剖鲜参，立即剔除内脏，迅速用双蒸水洗去污物，称量后将梅花参体壁置于洁净的大烧杯中，剪碎梅花参体壁； 步骤二 碱解梅花参体壁往梅花参体壁中加2倍重量的双蒸水，然后加入2mol/L的NaOH,边加边搅拌，使NaOH溶液终浓度为O. 5mol/L, 4°C过夜消化； 步骤三梅花参体壁的双酶酶解 胰蛋白酶酶解用冰醋酸调解PH值至8. 2，加入梅花参体壁质量O. 45%的胰蛋白酶，52°C水浴5h，水浴过程中充分搅拌，并滴加5 mmol/L的NaOH溶液，维持pH在8. 2 ;然后将酶解液迅速冷却至30°C以下，保持30min后终止反应； 胃蛋白酶酶解用6mol/L HCl调解pH值至2之间，再添加梅花参体壁质量O. 40%的胃蛋白酶，在50°C的水浴中继续酶解4h，水浴过程中充分搅拌；酶解终止前取酶解液5mL与玻璃试管中，滴加5%的三氯乙酸溶液进行检测，当溶液呈微混浊时，将酶解液迅速冷却至300C以下，保持30min终止酶解反应；然后以5000r/min离心15min收集上清夜； 步骤四酶解完毕后，用三氯乙酸处理双酶酶解上清夜，三氯乙酸的添加量为酶解液的10%，逐步添加，边加边搅拌，使酶解液变混浊为止；将溶液保存在冷藏室中静置12h，然后以5000r/min离心25min收集上清夜； 步骤五乙醇沉淀梅花参糖胺聚糖滴加5mmol/L的NaOH溶液调解上清液的pH值至6.8，7000r/min离心lOmin，收集上清加入无水乙醇，边加边搅拌，使乙醇终浓度为55%，4°C过夜沉淀； 步骤六干燥梅花参糖胺聚糖粗糖7000r/min离心IOmin,收集沉淀,用95%的乙醇洗涤3次，再依次用无水乙醇和丙酮分别洗涤和脱水I次；使沉淀物种的乙醇和丙酮自然挥发，沉淀物半干燥时，用低温真空干燥机进一步干燥，得到粗制梅花参糖胺聚糖； 步骤七梅花参糖胺聚糖脱色将沉淀物再次充分溶解于双蒸水中，用2mol/L NaOH调解PH至9. O, 50°C保温，逐步加入30%的双氧水进行多糖的脱色处理，溶液接近白色时终止脱色；将溶液冷却至室温，然后于4°C静置2h ；3600r/min离心15min去沉淀，转移上清液至新离心管中冷却至0°C，回调上清液pH为2. 0，再次3600r/min离心15min，去除少量沉淀，上层清液经80%乙醇沉淀，沉淀物真空干燥； 步骤八将50g DEAE-52纤维素用缓冲液浸泡过夜，脱气后装柱，用2倍柱床体积的缓冲液平衡；将30mg沉淀物用IOmL缓冲液在40°C下溶解上柱，用缓冲液和1. 5mol/L的NaCl各150mL梯度洗脱，流速采用8mL/h，以3mL/管收集；用阿利新蓝比色法检测各管总糖 胺聚糖的含量，收集有洗脱峰部分的样液，透析脱盐后，旋转蒸发器浓缩。所述缓冲液采用O. 5mol/L 的 NaAC，其 pH 为 6. O。步骤九用乙酸钾沉淀梅花参糖胺聚糖；将梅花参糖胺聚糖按1:90的质量比充分溶解于双蒸水，以3600r/min离心15min去沉淀；转移上清至新离心管中，加入乙酸钾至其终浓度为2mol本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从梅花参中提取并纯化糖胺聚糖的方法，其特征在于：包括下列步骤：步骤一：梅花参预处理；步骤二：碱解梅花参体壁；步骤三：双酶酶解梅花参体壁；步骤四：酶解完毕后，用三氯乙酸去除双酶酶解液中的蛋白质；步骤五：用乙醇沉淀梅花参糖胺聚糖；步骤六：干燥梅花参糖胺聚糖粗糖；步骤七：双氧水脱色；步骤八：用纤维素离子交换柱层析法纯化梅花参糖胺聚糖；步骤九：用乙酸钾沉淀梅花参糖胺聚糖；步骤十：干燥梅花参糖胺聚糖精糖。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宣世英，李雪洁，林中华，姜曼，姜相君，辛永宁，
申请(专利权)人：青岛市市立医院，
类型：发明
国别省市：