本发明专利技术提供了一种制备α1-抗胰蛋白酶的方法，它包括如下步骤：a.沉淀溶解b.PEG沉淀；c、病毒灭活；d、纯化；e.超滤；f、纯化；g.超滤透析；i.除菌分装,冻干。本发明专利技术方法采用改良Kistler和Nitschmann法工艺的废弃组分沉淀FIV来制备α1-抗胰蛋白酶，既解决了长期困扰的K-N工艺或其改良工艺制备α1-抗胰蛋白酶的难题，实现了血浆资源的综合利用，又对血浆蛋白主体分离工艺无干扰影响，PEG4000用量少，操作体积小，不使用离心设备，简化工艺，节省设备投入具备了很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及运用改良K-N法组份IV沉淀制备人α1-抗胰蛋白酶的方法，属血浆蛋白领域。
技术介绍
α1-抗胰蛋白酶(Alpha-lantitrypsin AAT)。分子由394个氨基酸组成，分子量为52000的糖蛋白，以天然有活性及变性无活性两种形式存在，由肝脏产生，主要功能为抑制胰蛋白酶和中性白细胞的弹性蛋白酶的活性，还可抑制糜蛋白酶，纤维蛋白溶酶等， 为人体内功能最强大的酶抑制剂之一。AAT先天性缺乏如基因突变或后天因素如长期吸烟或细菌感染会造成AAT活性中心失活，都会导致AAT功能性不足进而造成机体蛋白酶与抗蛋白酶系统失衡，肺组织抵抗弹性蛋白酶的能力下降，引起肺泡变形及末端小支气管以及下肺空间扩张等肺组织的慢性损害，会发生泡性肺气肿，慢性阻塞性肺病(C0PD)，成人呼吸道窘迫症(ARDS)，现阶段美国FDA批准的临床适应症为α1-抗胰蛋白酶遗传性缺乏引起的肺气肿，临床上一直就存在着采用AAT制剂进行增补治疗的需求。由于α1-抗胰蛋白酶自身具备抗炎，抗感染以及抗自身免疫反应等多功能特性，故在炎症性肠病(Inflammatory bowel disease IBD),脂膜炎,脉管炎,鼻窦炎,风湿性关节炎,糖尿病I型,糖尿病所引起足病，囊性纤维化(粘滞症)，支气管扩张，肌纤维痛，某些皮肤病像牛皮癣等常见慢性疾病具备潜在治疗价值。国外公司在进行扩大适应症方面的尝试并取得了进展，扩大的适应症为支气管扩张(Bronchiectasis)和囊 性纤维化疾病(Cystic fibrosis),糖尿病I型。另有国外公司采用基因重组技术基于酿酒酵母系统表达的重组α — I抗胰蛋白酶rAAT，剂型为胶体，进行了特应性皮肤病的临床试验。rAAT也在进行针对其它皮肤炎症，例如银屑病以及中耳炎的临床前研究。至今国内没有商品供应临床治疗需要。开发AAT能有利于宝贵的血浆资源的综合利用，极大地提升血浆蛋白生产的附加利润。因此开展AAT的研发不仅有很好的经济效益而且会有极佳的社会效益。国内外文献及专利报道α1-抗胰蛋白酶剂提纯原料常为Cohn法组分IV-1。 科恩等 Coan et al -Preparation and Properties of Alpha1-Proteinase Inhibi tor Concentrate from Human Plasma Vox Sang. 48:333-342 (1985)发表的米用 Cohn 法组分IV -1为原料，两步PEG沉淀，第一步为11. 5%为去除杂蛋白，第二步28%为富集沉淀α1-抗胰蛋白酶，再经一步DEAE-Sepharose CL-6B层析，巴氏法病毒灭活，该制剂含有12%白蛋白，2. 5%IgA,具备生物活性即抑制猪弹性蛋白酶(PPE活性)的AAT仅占总蛋白含量的60%，基于此工艺，美国Bayer公司开发出全世界第一个α 1_抗胰蛋白酶产品 PlOlastiη海因等 Hein et al !Production of Alpha 1-Proteinase inhibitor (Human) Eur· RespirJ.9:16s-20s(1990)发表的工艺采用Cohn法组分IV -1为原料，采用PEG沉淀和阴离子交换层析，最终产品的纯度为60%。朱威等α1-抗胰蛋白酶制剂的制备及其病毒灭活，中国生物制品杂志，2001，14 (2) =97-101发表了 Cohn法组分IV抽提液经两次沉淀，第一次去杂，第二次富集α1-抗胰蛋白酶及离子交换批量吸附及凝胶过滤纯化α1-抗胰蛋白酶，工艺中仅采用一次病毒灭活，采用的是巴氏法。有改为两步病毒灭活措施的必要， 并且工艺中有PEG4000用量大的缺陷。莱宾等Lebing et al :美国专利No. 6，462，180: 采用Coan IV -1为原料,经PEG沉淀,再经两步离子交换层析。病毒灭活方法采用去污剂 (Tween20),纳米过滤，冻干后干热病毒灭活，此专利技术中病毒灭活工艺较为繁复，可以进一步优化。卜凤荣等专利申请号200610103642.X，专利技术名称α1-抗胰蛋白酶的制备方法，公开了采用组分IV -1为原料，提取α1-抗胰蛋白酶，病毒灭活方法为S/D病毒灭活和巴氏消毒法的组合，但制备采用PEG沉淀加一步阴离子交换层析，纯度还达不到高纯的标准。随着国内血衆蛋白分离技术的发展，Kistler与Nitschmann法及其改良法也广泛地为国内厂家所采用。改良Kistler和Nitschmann法(简称改良K-N法)确实提升了主要血浆蛋白制品白蛋白的收率。但也造成了一些问题，一些重要的血浆蛋白制品如α1-抗胰蛋白酶等制备困难。采用Cohn法离心工艺处理I吨血衆可得17-20kg FIV-1蛋白沉淀,而改良Kistler与Nitschmann法处理I吨血衆可得IOOkg FIV沉淀(其中50kg蛋白沉淀和 50kg助滤剂)，由此可见,采用改良Kistler与Nitschmann法的FIV沉淀中的杂蛋白含量远高于Cohn法FIV-1沉淀，故纯化难度也高出许多。国际上有一些厂家及研究者，如法国伯尔诺夫等Burnouf et al ^'Biochemical and Biological Properties of ana 1-antitrypsin Concentrate，，VoxSang 52:291-297(1987)应用Kistler与Nitschmann法的组份A或组份A+ I上清经层析柱进行分离纯化α1-抗胰蛋白酶，该方法存在对设备要求较高，需要大规模的层析系统及配套设施，操作时间较长，病毒灭活不充分等缺陷。
技术实现思路
为了解决上述问题,本专利技术运用改良Kistler和Nitschmann法工艺的废弃沉淀 FIV来纯化制备α1-抗胰蛋 白酶，提供了一种制备α 1_抗胰蛋白酶的方法。本专利技术提供了，它包括如下步骤a.沉淀溶解采用低温乙醇法中的改良K-N法组份IV沉淀(按专利号 ZL03135795. 4，名称“一种血浆蛋白分离方法”所述的方法制备)溶解于8_12倍体积的 PH8. 1-9. O的缓冲液中，常温分散搅拌I小时，30-40°C加热搅拌I小时，常温搅拌4_14小时，整个溶解过程6-16小时，得溶解液；b. PEG沉淀将a步骤溶解液冷至5°C，加入PEG3000-6000浓度为6-10% (g/ml)， 搅拌，用酸调整PH值至5. 05-5. 35，加入1. 0-2. 0%助滤剂，搅拌过滤得到PEG上清液，滤液用碱调到ρΗ7· O ；C、病毒灭活S/D法；S/D病毒灭活完成后用等体积缓冲液进行稀释终止来保存 α1-抗胰蛋白酶的生物活性；d、纯化采用阴离子交换层析纯化；e.超滤;f、纯化采用阳离子交换层析纯化；g.超滤透析；h. 15nm 纳米过滤；1.除菌分装，冻干。其中，所述的步骤a还包括将搅拌后溶解液弃去沉淀，在上清液中加入2-3%助滤剂，边搅拌边进行压滤得滤液，超滤浓缩至约滤液体积的1/6-1/7，浓缩后蛋白浓度控制在 5. 1-6. 0%得超滤浓缩液，再进行b步骤PEG沉淀。其中，S/D病毒灭活为采用1%了界661180/0.39^他？，在24±11，6小时，5/1)病毒灭活完成后用等体积缓冲液进行本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备α1?抗胰蛋白酶的方法，其特征在于：它包括如下步骤：a.沉淀溶解：采用低温乙醇法中的改良K?N法组份Ⅳ沉淀溶解于8?12倍体积的pH8.1?9.0的缓冲液中，常温分散搅拌1小时，30?40℃加热搅拌1小时，常温搅拌4?14小时，得溶解液；b.PEG沉淀：将a步骤溶解液冷至5℃，加入PEG3000?6000，PEG浓度为6?10%（g/ml），搅拌1小时，用酸调整pH值至5.05?5.35，加入1.0?2.0%助滤剂，搅拌过滤得到滤液，滤液用碱调到pH7.0；c.病毒灭活：用S/D法灭活；d.纯化：采用阴离子交换层析纯化；e.超滤；f.纯化：采用阳离子交换层析纯化；g.超滤透析；h.15nm纳米过滤；i.除菌分装,冻干。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡骏，李泽林，刘波，初毅波，邓红，吴强，
申请(专利权)人：成都蓉生药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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