一种AFP重组蛋白和体外重组表达的方法技术

本发明专利技术涉及AFP重组蛋白和体外重组表达的方法，具体涉及一种人工信号肽-AFP-609aa-6his的重组蛋白和哺乳动物瞬时表达系统体外重组表达方法，其蛋白质序列如SEQ?ID?NO:1所示，a.将重组蛋白基因通过双酶切克隆到pcDNA3.1+载体中，构建pcDNA3.1+-AFP表达质粒，并进行质粒抽提；b.将抽提得到的pcDNA3.1+-AFP质粒用PEI转染进CHO-S悬浮细胞进行重组蛋白的表达；c.7天后分离纯化得到的重组蛋白。本发明专利技术通过大规模瞬时悬浮CHO-S表达系统制备的人工合成AFP蛋白活性跟天然AFP蛋白相近，且得到的纯度较高，内毒素含量低，无动物源性蛋白的污染，可以有望作为肝癌免疫治疗的肿瘤抗原疫苗。

【技术实现步骤摘要】
一种AFP重组蛋白和体外重组表达的方法本专利技术涉及AFP重组蛋白和体外重组表达的方法，具体涉及一种人工信号肽-AFP-609aa-6his的重组蛋白和哺乳动物瞬时表达系统体外重组表达方法。原发性肝细胞癌(primaryhepatocellular carcinoma，PHC,简称肝癌)是常见的恶性肿瘤之一，全球年发病病例大约为120万人。目前，肝癌治疗的总体疗效仍很不理想，临床上肝癌的治疗方法主要有外科切除、 肝移植等。外科切除的病人的复发率很高，术后3年复发率为50%，5年复发率为70%。肝移植治疗，尤其是活体肝移植虽然取得了一定的进展，但却面临着供体来源缺乏等问题。因此，临床上迫切需要研究和发展新的治疗肝癌的方法。近年来，随着免疫学和分子生物学基础理论研究的迅猛发展，以及人们对肝癌细胞生物学特性认识的加深，肝癌免疫治疗成为新的肿瘤治疗方法。目前已知的可能成为肝癌免疫治疗的靶抗原有AFP、MAGE家族、HBV/HCV病毒抗原，以及一些癌基因(myc、fos、ras)坐寸οAFP是人体胎儿期血液中出现的一种特殊蛋白质。它在胎儿的肝细胞内合成。 AFP在成人血清中含量极微，但在肝细胞功能发生异常，特别在患有原发性肝细胞癌时，血清中又可出现AFP升高，所以临床上常常借助AFP的检查作为原发性肝细胞癌的辅助诊断。50% 80%的肝癌患者表达AFP，并且在血清中的浓度可能超过I mg/ml。在人体发育过程中，T细胞库内针对AFP的特异性CTL克隆并未清除，适当条件和方法可以将之激活， Butterfield等将4条AFP表位肽包裹在不完全福氏佐剂里，对6例HLA A2.1阳性、表达 AFP的HCC病人进行皮内免疫，5例病人对其中的3条表位肽显示了 AFP肽特异性T细胞扩增。基础研究表明，DC是体内功能最强的专职抗原递呈细胞，但由于肝癌患者体内DC大多数处于不成熟状态，其功能存在障碍，诱导同种异体淋巴细胞增殖的能力降低。通过体外诱导DC成熟，并负载AFP来源的表位肽，激活特异性CTL杀伤肝癌细胞的能力。哺乳动物表达系统在蛋白的起始信号、加工、分泌、糖基化方面具有独特优势，适合表达完整的大分子蛋白。由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质。由于近几年生物技术公司对哺乳动物表达系统的研发，相应的已经推出了较好的表达系统，大大提高了外源蛋白在哺乳系统里的表达量。随着悬浮系统的日益成熟化，现在大规模瞬时表达外源蛋白已经成功，目前已经能达到mg至g级别。中国仓鼠卵巢细胞CHO作为表达宿主， 其优势有以下几点遗传背景清楚，生理代谢稳定；与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确；基因转移和载体表达系统完善；耐受剪切力，便于大规模培养；被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞。为了能够大规模的制备高纯度的AFP蛋白，本专利技术提供一种人工信号肽-AFP-609aa-6his的重组蛋白及其制备的方法。为实现上述目的，设计一种人工信号肽-AFP-609aa_6his的重组蛋白，其特征在于其蛋白质序列如SEQ ID NO:1所示。人工信号肽的碱基序列如SEQ ID NO 2所示。本专利技术还包括一种用哺乳动物瞬时表达系统体外表达所述重组蛋白的方法，包括重组蛋白基因的合成，其特征在于该方法包含以下步骤a.利用基因合成技术，合成人工信号肽-AFP-609aa_6his序列b.将人工信号肽-AFP-609aa_6his基因序列通过双酶切克隆到pcDNA3. 1+载体中，构建pcDNA3.1+-AFP表达质粒，并进行质粒抽提，C.将抽提得到的PCDNA3.1+-AFP质粒用PEI转染进CHO-S悬浮细胞进行重组蛋白的表达，d. 7天后分离纯化得到的重组蛋白。用N1-柱来分离纯化。用Hind III和EcoR I进行所述的双酶切。上述的重组蛋白能应用于肝癌治疗药物。本专利技术主要包含四个方面的内容(1)利用基因合成技术，合成重组AFP DNA 序列，然后将序列克隆到pcDNA3. 1+载体中，构建pcDNA3.1+-AFP质粒，大规模制备 pcDNA3.1+-AFP质粒；(2)使用CHO悬浮表达系统表达重组AFP蛋白；(3)使用Ni — NTA 柱从悬浮 细胞上清液中分离纯化重组AFP蛋白。(4)将纯化后AFP蛋白刺激树突状细胞 (dendritic cells, DC),用活化后的DC细胞将T细胞激活，形成CTL杀伤H印G2细胞，用 MTT法检测杀伤率。本专利技术目的通过大规模瞬时悬浮CHO-S表达系统制备的人工合成AFP蛋白活性跟天然AFP蛋白相近，且得到的纯度较高，内毒素含量低，无动物源性蛋白的污染，可以有望作为肝癌免疫治疗的肿瘤抗原疫苗。[附图说明]图1是哺乳动物表达系统的质粒pcDNA3. 1+图谱，图2是pcDNA3.1+-AFP的酶切鉴定琼脂糖电泳图，图3是SDS-PAGE分析纯化后重组AFP蛋白图，图4是Western-blot分析纯化后重组AFP蛋白图，图5是MTT法检测经CTL处理的!fepG2细胞生长数据图。图1中的图谱的具体信息为CMV 启动子(CMV promoter) : bases 232-819T7 启动子 / 引物绑定位点(Τ7 promoter/priming site) : bases 863-882多克隆位点(Mutiplecloning site) : bases 895-1010反链的引物结合位点(pcDNA3.1/BGH reverse priming site): bases 1022-1039BGH 多腺苷酸序列(BGH polyadenylation sequence) : bases 1028-1252fl 复制起始位点(fl origin) : bases 1298—1726sv40 早期启动子和复制起始位点(SV40 early promoter and origin) : bases 1731-2074新霉素抗性基因(开放读码框)Neomycinresistance gene (ORF) : bases 2136-2930SV40 多腺苷酸信号(SV40 polyadenylation signal) : bases 3104-3234PUC 复制起始位点(pUC origin) : bases 3617-4287 (互补链 complementary strand)氛卡青霉素抗性基因Ampicillin resistance gene (bla) : bases 4432-5428 (互补链 complementary strand)开放读码框(ORF): bases 4432-5292 (互补链 complementary strand)核糖体结合位点(Ribosomebinding site) : bases 5300-5304 (互补链 complementary strand)Bla 启动子 Bla promoter (P3) : bases 5327-5333 (互补链 complementary strand)[具体实施方式]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本专利技术进行进一步本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人工信号肽?AFP?609aa?6his的重组蛋白，其特征在于其蛋白质序列如SEQ?ID?NO:1?所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陆玲玲，苏国新，叶永清，
申请(专利权)人：上海柯莱逊生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：