本发明专利技术属于医药技术领域，涉及一种靶向EGFR受体的多肽及其应用，本发明专利技术的设计来自于EGFR主要自磷酸化作用位点的小肽EY1068INQ（SEQ?ID?NO:1），PDY1148QQD（SEQ?ID?NO:2），AEY1173LR（SEQ?ID?NO:3），所述的肽用于修饰纳米脂质载体，所述的纳米脂质载体包括固态脂质材料、液态油、脂溶性乳化剂、PEG修饰的脂类、水溶性乳化剂、附加剂。本发明专利技术具有如下特点：（1）得到的多肽，分子量小，合成方便，成本低廉，与EGFR亲和力高，特异性强。（2）本发明专利技术得到的小肽，具有良好的EGFR靶向性，可用于构建靶向治疗EGFR高表达的肿瘤的载体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种靶向EGFR受体的多肽及其应用，尤其涉及其在修饰的纳米脂质载体中的应用，属药物制剂领域。
技术介绍
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)广泛分布于人体各组织细胞膜上，是一种多功能跨膜糖蛋白，属受体型酪氨酸蛋白激酶(RTK)。与正常细胞相比，肿瘤细胞特别是EGFR阳性肿瘤细胞的生长明显依赖于EGFR信号转导，且有显著的降调节机制缺陷，其EGFR表达水平可比正常细胞高几千倍。EGFR的信号传导网络在肿瘤的形成和发展过程中占据了重要地位，是治疗肿瘤的一个很有前景的靶分子，是研究的热点。然而越来越多的研究发现，以单克隆抗体或其片段作为配基介导肿瘤靶 向治疗， 因靶向配基具有免疫原性在临床应用具有一定局限性。目前，人源化、小型化的小分子多肽几乎不被免疫系统注意，且能有效穿透组织并具有被癌细胞选择性结合和内化的能力使其在提高肿瘤治疗靶向性方面具有较大优势。据文献报道，EGFR含有3个可以调控EGFR活性的主要自磷酸化作用位点，分别为 Y1068, Y1148和Y1173。采用序列比较/结构分析的方法设计和筛选了来源于三个主要作用位点的氨基酸序列作为靶向EGFR小分子多肽配体。纳米脂质载体(Nanostructrued lipid carries, NLC)是由固体脂质纳米粒 (Solid lipid nanoparticles, SLN)发展而来的一种新型载药系统。NLC采用生物相容性好、毒性低的类脂材料为载体，制备过程中通过向固态脂质中加入化学差异很大的液态油， 使纳米粒以结晶缺陷型或无定型结构存在，可避免放置过程中脂类由高能态的α、β型结晶向规则的β型转变，避免或减小SLN放置过程中药物外排的现象，提高药包封率及稳定性。普通纳米粒如SLN或聚合物纳米粒进入体内后，被机体视为异物，易被单核巨噬细胞系统及网状内皮系统(RES)识别并吞噬，在静脉给药时只能作用于吞噬细胞比较丰富的器官，如肝脏、脾等。但若病灶部位不在网状内皮系统，该类制剂则会增加药物对网状内皮系统的毒性。长循环纳米脂质载体(long-circulating NLC)是以PEG对NLC表面进行修饰，PEG链与水分子的相互作用可在NLC表面形成一层固定水化层，由于血浆蛋白不能与亲水表面结合，因此，固定水化层的形成可以防止调理素及蛋白的吸附，避免RES吞噬，延长纳米粒在体内的循环时间，使其进入肿瘤等病变部位的机会增加，提高药物在病灶靶部位的疗效。靶向EGFR的多肽作为靶向配基，并将其与包载抗肿瘤药物的长循环纳米脂质载体偶联，基于肽配体可与肿瘤细胞表面过度分泌的EGFR特异性结合的原理，将包载化疗药物的长循环纳米脂质载体靶向浓集于肿瘤组织，经部分生物降解后，NLC通过EPR效应进入肿瘤组织，对肿瘤进行特异性治疗，改善化疗药物的治疗效果，降低对正常组织的毒副作用。
技术实现思路
1.本专利技术的目的是提供与EGFR具有亲和性的小分子肽，并提供该相关小肽的分子结构。2.本专利技术的另一目的是提供上述小肽在构建肿瘤靶向给药系统中的用途。3.本专利技术通过下述技术方案实施首先设计来自于EGFR主要自磷酸化作用位点的小肽 EY1ci68INQ ( SEQ ID NO:1), PDY1148QQD (SEQ ID NO:2)，AEY1173LR (SEQ ID N0:3),选择 LARLLT (Shuxian Song, et al. Novel peptide ligand directs liposomes toward EGFR high-expressing cancer cells in vitro and in vivo, FASEB J. 23(2009) 1396-1404.)作为对照，对上述各肽进行FITC标记。采用流式细胞术分析上述各肽与表达 NC1-H1299及K562不同细胞系的结合率。获得与EGFR高表达的NC1-H1299细胞具有较高的亲和活性的肽AEY1173LR,包含氨基酸序列Ala Glu Tyr Leu Arg (以下简称PE5)的肽。4.经体内外亲和性及靶向性评价，结果证实，所述的小肽具有与EGFRG高表达的细胞特异亲和的特性；所述的小肽用于修饰载药纳米粒、脂质体、泡囊或胶束，构建成肿瘤靶向给药系统，该类系统能够提高药物在肿瘤组织的浓度，增强治疗效果，降低全身性的毒副作用。5.本专利技术的小肽可用本领域熟知的多肽合成仪或固相方法进行合成。如采用有机化学固相合成Fmoc法合成小分子肽，由C端至N端合成，即将该小肽C端的第一个Fmoc-AA 的羧基活化后与HMP树脂结合，再脱去Fmoc-保护基，与第二个羧基活化的Fmoc-AA结合， 再脱去Fmoc-保护基，循环重复，直至合成得到肽树脂，然后用TFA将肽从肽树脂上切下，得到粗品小肽。采用高效液相色谱法对小肽粗品进行纯化和纯度检测。洗脱系统为①A液: O. 1%TFA的水溶液。②B液B为 含O. 1%TFA的乙腈溶液。用95%A, 5%B 60%A, 40%B，手动进样，1 mL/次,流速4 mL/min,线性梯度,20 min内。275.5 nm处检测紫外吸收,按峰收集组分，冻干，进行纯度检测，贮藏在-20 ° C冰箱中备用。纯化后的肽以质谱法进行鉴定。通过液相色谱纯化，纯度在98%以上，外观为白色粉末，并通过质谱进结构鉴定 本专利技术小肽的分子量是650. 74，质谱特征峰651. 27。6.本专利技术的肽与纳米脂质载体(NLC)的结合为通过接头的共价结合。接头为能够共价连接本专利技术的肽和纳米脂质载体的物质的交联剂。交联剂通常与本专利技术的肽和纳米脂质载体上存在的功能基团(例如-NH2，-C00H，-mal)反应。由于不同交联剂与不同功能基团反应的能力不同，可以选择不同的交联剂。所述的本专利技术的肽偶联的纳米脂质载体的制备方法为首先采用具有 DSPE-PEG-C00H、DSPE-PEG-NH2、DSPE-PEG-mal的脂质制备纳米脂质载体，然后加入交联剂将PE5连接到纳米粒上。具体步骤如下(1)将固态脂质材料、液态油、脂溶性乳化剂溶于有机溶剂中，该有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙醇或异丙醇，并加热至60 100°C熔融，以构成有机相；(2)将PEG修饰的脂类、水溶性乳化剂、附加剂溶于注射用水中，并加热至60 100°C， 以构成水相；(3)在60 100°C的温度下，在搅拌或/和高剪切条件下将所述有机相和水相混合，以制备初乳；(4)对所述初乳进行超声或高压均质处理，并倾入冰水中，从而制得长循环纳米脂质载体。(5)长循环纳米脂质载体混悬于适当缓冲液中(pH 4. O 6. O)中，分别加入 EDC和S · NHS的水溶液，室温下反应10 15m in。然后调pH至7. O 8. 5，加入PE5， 室温孵育过夜，除去游离PE5，即得PE5修饰的长循环纳米脂质载体。可用于实施本专利技术的抗肿瘤药物包括但不限于羟基喜树碱、阿霉素。7.本专利技术具有以下有益的技术效果(I)本专利技术得到的多肽，分子量小，合成方便，成本低廉，与EGFR亲和力高，特异性强。(2)本专利技术得到的小肽，具有良好的EGFR靶向性，可用于构建靶向治疗EGFR高表达的肿瘤的载体。附本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种靶向EGFR受体的肽，其特征在于：靶向EGFR受体的肽的序列如SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2或SEQ?ID?NO:3所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：潘卫三，韩翠艳，杨星钢，太玲钰，孙明爽，李静，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，
类型：发明
国别省市：
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