本发明专利技术提供了一类细胞色素P450?3A4酶的特异性探针底物及其在CYP3A4酶活测定中的应用，其中酶活测定的具体操作流程如下：选择任一蟾蜍甾烯类系列化合物中的单体作为高特异性探针底物，并借助CYP体外孵育体系开展特异性底物的CYP催化反应，通过定量检测单位时间内产物生成量或底物消除量来测定各生物样品及细胞中CYP3A4酶的活性。本发明专利技术可用于不同种属、不同个体来源生物样本中CYP3A4酶活的定量评估，以及不同来源的动物组织细胞培养液及细胞制备物中CYP3A4酶活的定量测定。
【技术实现步骤摘要】
—类细胞色素P450 3A4酶的特异性探针底物及其应用
本专利技术属医药
，具体涉及一类蟾蜍留烯类化合物,如华蟾毒精、去乙酰华蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒灵三个化合物及其结构类似物，其可作为细胞色素P450 3A4酶的特异性探针底物，用于不同来源生物样本中细胞色素P450 3A4酶活的定量测定，以期实现对重要药物代谢酶CYP 3A4处置药物能力的评估。
技术介绍
细胞色素P450酶(Cytochrome P450, CYP)超家族包含了机体内最重要的药物代谢酶，参与约80%以上上市药物的代谢，其中经细胞色素P4503A亚家族代谢的药物约占50%。人体中表达了四种细胞色素P4503A亚型，分别为细胞色素P4503A4、P4503A5、 P4503A7以及P4503A43。细胞色素P4503A4占总细胞色素P450酶含量的30 60%(Annu Rev Pharmacol Toxicol 1999，39:1 - 17)，在肝、肠、肾、脾、心脏各器官中有非常广泛的分布，相比于人群中表达量低、表达频率低的细胞色素P4503A5, —直被认为是成年个体表达的最主要的细胞色素P4503A单酶。一般来讲，CYP3A亚家族中的各种亚型的酶都具有相似的底物具体性，也就是说，某一底物若被CYP3A4催化代谢，那么这一底物就极可能同时被CYP3A5及其它CYP3A家族的酶代谢。目前，已经发现的或已在体外、体内研究中广泛应用的CYP3A亚家族探针底物,如咪达唑仑(midazolam)、尼非地平(nifedipine)、睾酮 (testosterone)、雌二醇(estradiol)等，都同时是CYP3A4和CYP3A5的特异性底物。相对应的，利用这些探针底物对细胞色素P450酶进行的评估结果反映的就是细胞色素P4503A 亚家族各单酶的催化能力的总和。然而，近期的研究发现，细胞色素P4503A5在某些个体中显现的催化能力甚至与细胞色素P4503A4的催化能力相当(Drug Metab Dispos 2002, 30:883-91 )，此时利用目前已有的探针则会混淆细胞色素P4503A4和3A5的催化能力，从而无法清晰地分析细胞色素P4503A4对某药物的代谢清除能力。此外，在鼠(细胞色素P4503A1、细胞色素P4503A2)、狗(细胞色素P4503A12、细胞色素P4503A26)，兔( 细胞色素P4503A6)，猪(细胞色素P4503A29)，猴(细胞色素P4503A64) 等哺乳动物体内，也高表达细胞色素P4503A4的同功酶，这些酶之间的底物有非常广泛的重叠性。利用细胞色素P4503A4的高特异性探针也可在体外活性测定方面实现对不同种属中细胞色素P4503A4的同功酶的评价与考察。目前，细胞色素P4503A4酶活性的体外评价体系主要包括重组单酶、哺乳动物的亚细胞组分、新鲜提取的肝细胞、原代培养肝细胞、肝切片、肝灌流等(Toxicology in Vitro 2006，135 - 153)，其中已经商品化的重组细胞色素P4503A4单酶主要来自于细菌、 昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌建立的克隆表达体系，而亚细胞组分主要包括微粒体、 细胞胞浆及S9成分。采用这些标准化的评价体系，结合相应的辅因子(如=NADPH等)和孵育条件，可通过检测探针底物的代谢清除或产物生成速率，对上述各种体系中表达的细胞色素P4503A4酶活性进行表征。余琢(CN101308119)等人还利用肝微量穿刺法构建了新型微量肝组织体外孵育体系，并采用咪达唑仑作为探针底物，通过测定咪达唑仑与其代谢产物I 一羟基咪达唑仑含量的比值，来作为细胞色素P4503A体外活性评价指标。综上所述，评估细胞色素P4503A4代谢酶活性，关键在于选择高特异性的探针药物。
技术实现思路
本专利技术涉及一类蟾蜍留烯类化合物以及其在检测细胞色素P4503A4酶活性中的用途及其检测方法，蟾蜍留烯类化合物(bufadienolides)是一类留体类成分，该系列化合物具有图1所示的基本结构，它可作为细胞色素P450 3A4酶的高特异性探针底物，用于定量测定不同来源生物样本中CYP3A4酶活。与目前已报道的细胞色素P4503A探针/标准底物不同，蟾蜍留烯类系列化合物中的单体具有高特异性表征细胞色素P4503A4酶活性的能力，其并不被CYP3A5催化。因此能够高特异性的评价机体或组织中CYP3A4酶对药物的处置能力，对体外药物代谢研究具有重要意义。本专利技术具体提供了一类细胞色素P450 3A4酶的特异性探针底物，其特征在于所述细胞色素P450 3A4酶的特异性探针底物为一类具有图1所示结构的蟾蜍留烯类系列化合物中的单体，其中R1为一H、一OH或一OAc基团。其中蟾蜍甾烯类系列化合物中的单体优选华蟾毒精、去乙酰华蟾毒精、酯蟾毒配基或蟾毒灵。 本专利技术还提供了所述细胞色素P450 3A4酶特异性探针底物的应用，，其特征在于用蟾蜍留烯类系列化合物单体中的一种作为特异性探针底物，通过定量定时测定相应代谢产物的生成量或底物的减少量实现细胞色素P4503A4酶活性的检测。采用重组细胞色素P450单酶，肝微粒体孵育体系进行考察，通过相关性分析， 特异性抑制实验，重组单酶代谢反应，以及酶反应动力学几方面的证据，证明华蟾毒精 (cinobufagin, CB),酯蟾毒配基(resibufagenin, RB)和蟾毒灵(bufalin, BF)三个化合物均可特异性的经细胞色素P450 3A4酶代谢(如图2 4所示)，依次生成5 β -羟基华蟾毒精 (华蟾毒他灵)、Ia-羟化华蟾毒精，5 β -羟基酯蟾毒配基(海蟾蜍毒精)及5 β -羟基蟾毒灵 (远华蟾毒精)，UFLC图谱见图5 7，代谢产物的结构见图8。进一步采用各种哺乳动物的新鲜提取的肝细胞、原代培养肝细胞、肝切片、肝灌流等代谢评价体系进行考察，发现该代谢反应具有非常良好的特异性。作为高特异性的细胞色素Ρ450 3Α4的探针底物，华蟾毒精、去乙酰华蟾毒精、酯蟾毒配基、蟾毒灵等蟾蜍留烯类化合物中的任一单体均可以用来检测细胞色素Ρ450 3Α4 酶活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系生产的细胞色素Ρ450 3Α4重组酶的酶活测定，以及多种哺乳动物组织器官来源的微粒体、S-9等制备物中CYP 3Α4的活性标定。本专利技术提供的所述细胞色素Ρ450 3Α4酶的特异性探针底物的应用，即采用所述探针底物检测细胞色素Ρ450 3Α4酶活性，其测定方法及条件如下Α.选用蟾蜍留烯类系列化合物单体中的一种作为特异性探针底物；底物浓度为1-500μΜ ；B.在ρΗ=7.(Γ8. 5的缓冲液体系下加入NADPH或其生成体系的孵育体系，反应温度为 2(T60°C之间；C.反应时间为10-120分钟，在确保以上底物相应的羟化代谢产物达到定量限且底物转化率低于10%时终止反应；D.测定单位时间内底物减少量或单羟化产物生成量作为细胞色素P450 3A4酶活性的评价指标。其中检测底物减少量或其对应羟化产物生成量的定量检测方法为紫外吸收光谱、 质谱、放射性同位素示踪技术、荧光激发光谱、蒸发光散射或电化学光谱检测。所有检测器包括紫外吸收光谱检测器、质谱、放射本文档来自技高网...
【技术保护点】
一类细胞色素P450?3A4酶的特异性探针底物，其特征在于：所述细胞色素P450?3A4酶的特异性探针底物为一类具有式（1）或式（2）结构的蟾蜍甾烯类系列化合物中的单体，其中R1为—H、—OH或—OAc基团。dest_path_image001.jpg
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨凌，葛广波，宁静，吴敬敬，杜逊甫，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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