一步鉴别口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物的试纸条制造技术

本实用新型专利技术涉及一种快速鉴别口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物的试纸条，含有支撑层和吸附层，吸附层附着在支撑层上，吸附层从测试端依次为样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层和手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有检测印迹和对照印迹，金标抗体纤维层上吸附有胶体金标记的葡萄球菌蛋白A，检测印迹用大肠杆菌表达系统表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原和非结构蛋白3ABC抗原中的一种或两种印制，对照迹用羊或兔抗SPA的IgG抗体溶液印制。本实用新型专利技术的试纸条特异性强，灵敏度高，简便，直观，准确，适用范围广，成本低，专业和非专业人士均可随时随地实时检测，易于推广应用。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

一步鉴别口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物的试纸条
[0001 ] 本技术涉及一种检测口蹄疫病毒的器具，特别是涉及一种快速鉴别口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物的试纸条。
技术介绍
口蹄疫(Foot-and-mouth_disease,FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起偶蹄动物的一种烈性传染性疫病。FMDV具有多型性、易变性、宿主广泛性、传染力极强等特点，一旦发病即呈流行性、大爆发性。FMD的爆发和流行常给发病地区造成巨大损失，除动物死亡造成的直接经济损失外，还有动物患病期间肉和奶的生产停滞、病愈后肉和奶的产量长期下降以及种用价值丧失等较大损失。更为严重的是，FMD是一种烈性传染病，具有极强的传染性，对于发病动物以及接触病原的同群动物，必需进行严格隔离、封锁、禁止动物移动和畜产品上市等。因此，FMD导致发病地区甚至发病国家的畜产品进出口贸易停止，除造成巨大的经济损失外，还产生一定的政治影响。疫苗接种是发展中国家控制FMD的主要策略，由于FMD固有的特点，目前国内外的疫苗只能保护免疫动物不发生FMD，但是这种方法不能防止免疫动物再次发生FMDV的感染。在疫区的免疫动物群中，有一定数量的动物是病毒携带者，这些动物有可能持续向外排毒，在牛、羊体内形成持续性感染的病毒可长期存在。这些隐性感染或带毒的动物不但可能引发新的疫情，还为病毒变异和产生新毒株提供了环境。因此，FMDV疫苗免疫动物抗体水平以及如何区分免疫动物和病毒感染动物是控制FMDV的关键问题。目前使用的FMDV疫苗主要是灭活疫苗和合成肽疫苗。灭活疫苗免疫动物后，动物体内不会有病毒增殖，疫苗生产中在病毒纯化过程中已经去除了绝大部分的非结构蛋白 (NSP)，没有了非结构蛋白的表达，因而在免疫动物体内就不会有非结构蛋白抗体的产生， 多肽疫苗本身就是FMDV结构蛋白VPl上的一个主要抗原表位，更没有非结构蛋白的存在。 而FMDV感染的动物体内，在病毒装配过程中有大量非结构蛋白的表达，刺激机体产生相应的非机构蛋白抗体。结构蛋白抗体检测可以监控动物的免疫状态和抗体产生水平，非结构蛋白抗体检测技术为区分感染动物和免疫动物提供依据，结构蛋白和非结构蛋白检测技术的结合可以达到一步检测FMDV免疫抗体水平以及区分FMDV感染动物和疫苗免疫动物的目的。目前实验室检测FMDV抗体的方法有(I)病毒分离从患病动物的病料中分离出病毒，再对分离到的病毒进行培养鉴定做出诊断，确定是否FMDV感染。这种技术准确可靠， 但敏感性差，而且有些样品中存在补体活性，影响检测效果，并且需要专门的实验室。(2)病毒中和试验利用病毒与特异性血清中和抗体的相互作用，从而使病毒失去对易感动物和敏感细胞的感染能力，这一方法必须使用活病毒，普通实验室不能操作。(3)酶联免疫吸附试验(ELISA):主要有区分感染与免疫的非结构蛋白ELISA (I-ELISA)和检测疫苗免疫动物的血清抗体水平的液相阻断ELISA。ELISA方法测定时具有特异、敏感等优势，但操作复杂、费时、费力，需要特定的仪器设备和专业技术人员，很难在基层普及推广。同时，液相阻断ELISA方法需要灭活病毒的参与，因此，还存在病毒灭活不全或病毒逃逸等风险。此外， 近年来随着猪O型FMD合成肽疫苗的推广应用，已经逐步占据了主要市场，传统的液相阻断 ELISA很难对多肽疫苗抗体做出准确的检测结果。因此，研究一种简便快速、一步可以检测疫苗免疫和病毒感染的实时在线检测技术，非常重要而迫切。
技术实现思路
本技术要解决的技术问题克服现有技术中检测口蹄疫病毒抗体和疫苗抗体存在的缺陷，提供一种特异性强、敏感性高、简便、快速鉴别口蹄疫病毒抗体和疫苗抗体的免疫金标试纸条。本技术的技术方案一步鉴别口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物的试纸条，含有支撑层和吸附层，吸附层附着在支撑层上，吸附层从测试端依次为样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层和手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有检测印迹和对照印迹，所述金标抗体纤维层上吸附有胶体金标记的葡萄球菌蛋白A即SPA，所述检测印迹用大肠杆菌表达系统表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VPl抗原和非结构蛋白3ABC抗原中的一种或两种印制，对照印迹用羊或兔抗SPA的IgG抗体印制。所述支撑层用不吸水的硬质塑胶条或硬纸条制成；样品吸附纤维层用玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成；金标抗体纤维层用玻璃棉制成。所述纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纤维素膜、羧甲基纤维素膜或聚偏二氟乙烯 PVDF纤维素膜制成；所述吸水材料层用吸水纸制成。所述纤维素膜层上含有一条/个检测印迹时，检测印迹、对照印迹的排列形式为 “ I I ”、“十十，，、“丁丁，，、“丄丄，，、“ I- ρ，、“~| H，，和“籲 ”中的任一种；纤维素膜层上含有两条/个检测印迹时，检测印迹、对照印迹的排列形式为“ I I I ”、“十十十”、“I I 丁”、“丄丄丄，，、“ [_，，、“_! ” 和“# # 籲”中的任一种。在所述样品吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在样品吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线。本技术的积极有益效果I、检测特异性强、敏感性高本技术试纸条以胶体金标记的SPA为基础制备而成，金标SPA中的金颗粒与抗原或SPA分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对大肠杆菌表达系统表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VPl抗原和非结构蛋白3ABC抗原的特异性影响很小，也不影响SPA与抗体的结合及抗体与抗原的结合，且具有较高的标记率。因此，本技术的试纸条具有较高的特异性和敏感性，可检测到2纳克的相应抗体蛋白。2、操作简便、快速本技术的试纸条检测过程中无需附加其它仪器和试剂，只要将其测试端插入待检血清中30秒左右，等5分钟左右即可判定检测结果。3、结果显示直观、准确试纸条以显示棕红色的检测印迹和对照印迹作为检测的阳性和阴性标记，即在纤维素膜层上只显示一条棕红色对照印迹C，表示在被检血清中既无 FMDV感染抗体也无FMDV疫苗免疫抗体，即被检动物无FMDV感染也无FMDV免疫或免疫不合格；若在纤维素膜层上显示一条棕红色对照印迹C和两条棕红色检测印迹P、J，则表示被4检动物有FMDV感染；若在纤维素膜层上显示一条棕红色对照印迹C和一条棕红色检测印迹 P，则表示在被检血清中含有FMDV疫苗免疫抗体；结果判定直观、准确、简单明了，不易出现假阴性和假阳性的误判。4、生产系统可靠本技术中的检测印迹采用大肠杆菌表达系统作为生产系统，该表达系统的研究较为深入，已经过反复验证，作为生产系统时培养条件简单、基因操作容易，从构建到产物纯化周期较短，成本低，产量高，适合于工业化应用。5、投资少，成本低使用本技术试纸条不需要另配其它仪器、设备和试剂，节省大量仪器、设备和附加试剂费用；一条试纸条一次可以检测一种或两种抗体，专业和非专业人士均可随时随地进行实时在线检测，无需支付专家诊断费及相关费用，可节省检测成本，降低检测费用。6、应用范围广，便于推广本技术的试纸条操作简单成“一步式”、“傻瓜式”， 而且方便携带和保存，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品本文档来自技高网...

【技术保护点】
一步鉴别口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物的试纸条，含有支撑层和吸附层，吸附层附着在支撑层上，吸附层从测试端依次为样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层和手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有检测印迹和对照印迹，其特征是：所述金标抗体纤维层上吸附有胶体金标记的葡萄球菌蛋白A即SPA，所述检测印迹用大肠杆菌表达系统表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原和非结构蛋白3ABC抗原中的一种或两种印制，对照印迹用羊或兔抗SPA的IgG抗体印制。

【技术特征摘要】
1.一步鉴别口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物的试纸条，含有支撑层和吸附层，吸附层附着在支撑层上，吸附层从测试端依次为样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层和手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有检测印迹和对照印迹，其特征是所述金标抗体纤维层上吸附有胶体金标记的葡萄球菌蛋白A即SPA，所述检测印迹用大肠杆菌表达系统表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VPl抗原和非结构蛋白3ABC抗原中的一种或两种印制，对照印迹用羊或兔抗SPA的IgG抗体印制。2.根据权利要求I所述的试纸条，其特征是所述支撑层用不吸水的硬质塑胶条或硬纸条制成；样品吸附纤维层用玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成；金标抗体纤维层用玻璃棉制成。3.根据权利要求I所述的试纸条，其特征是所述纤维素膜层用硝酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：张改平，杨苏珍，卢清侠，职爱民，杨继飞，乔松林，邓瑞广，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：实用新型
国别省市：