用于病毒清除研究的病毒母液的纯度和效价对研究结果具有重要影响，且影响缩尺模型可以多好地代表生产规模方法。病毒母液中的杂质在测试小病毒保持性过滤器的过程中尤为重要，因为这些杂质可能引起过滤器过早地结垢，导致过滤器的真实通量能力被低估以及随后对生产规模单元的尺寸确定不当。另外，杂质也可通过改变结垢机制以及随后经过病毒过滤器的流体传递来影响所观察到的病毒清除程度。本文描述制备、生产和使用具有高效价的高纯度病毒母液的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请案本申请案要求2010年4月14日提交的美国临时申请案第61/324，220号的权益。以上申请案的全部教示内容以引用的方式并入本文中。
技术介绍
生物医药产品(例如单克隆抗体、重组蛋白、疫苗、血液衍生物和畜产品)携带传播感染性病毒的风险。这是由于来源物质可能内部受病毒污染。另外，生物医药产品的制造方法易受外部来源的病毒污染。因此，生物医药产品的制造商需要在其制造方法中并入足够的病毒清除步骤，以确保其产品无污染病毒。安全性和管理规则要求，生物医药产品的制造方法并入这些病毒清除步骤。对制造方法中病毒清除步骤的有效性进行评估是必要的。病毒清除评估的目的是·评定制造生产方法使潜在病毒污染物去活化和/或去除潜在病毒污染物的能力。掺加研究典型地在生产规模方法的縮尺模型中用于评估和验证病毒清除步骤。然而，用于病毒清除研究的病毒母液的纯度和效价对研究结果具有重要影响。病毒母液的纯度和效价影响缩尺模型可以多好地代表生产规模方法。例如，病毒母液中的杂质会不利地影响病毒清除步骤中所用的小病毒保持性过滤器的测试过程。杂质由于验证性掺加研究中使用的不纯病毒母液而被引入，且不反映生产规模方法上的典型制造方法。由于杂质，测试単元(例如过滤器)过早地结垢，展现改变的结垢条件，并且不利地影响经过病毒过滤器的流体传递。从而，过滤器的真实通量容量被低估，这又导致对生产规模单元的尺寸确定不当。因此，生产规模単元尺寸过大以弥补验证研究中这一単元的明显较低性能。这增加了生产成本。另外，这低估了测试单元在生产方法中清除病毒的实际能力，因为病毒母液的效价通常决定着掺加入测试物质中的病毒的最大可能浓度，当所有病毒均被测试单元有效清除时，效价限制了测试单元的病毒清除要求。当前生产病毒母液(例如用于掺加研究)的方法无法生产具有低杂质含量的病毒母液。此外，需要具有尽可能高效价的病毒母液，因为可以加入测试系统中的病毒掺加物的体积受管理准则的限制。当前的方法无法生产高效价和高纯度的病毒母液。因此，需要制备具有高纯度以及高效价的病毒母液的方法。
技术实现思路
本文中描述生产高纯度病毒母液的方法，以及通过所述方法生产的病毒和病毒母液。病毒可以是所期望的任何合适的病毒，例如哺乳动物病毒或噬菌体。这些病毒母液适合用作例如评估和/或验证研究中的病毒掺加物。因此，本专利技术的一个实施例是ー种制备高纯度病毒的方法。所述方法包含以下连续步骤获得在低蛋白质条件下制备的病毒样品，在合适的缓冲剂中浓缩病毒样品，以及在病毒样品中沉淀病毒，使得沉淀的病毒是高纯度病毒。在一个实施例中，高纯度病毒是高纯度病毒母液。在本专利技术的另ー个实施例中，制备高纯度病毒的方法包含色谱精制(chromatographic polishing)。在一个实施例中，制备高纯度病毒的方法包含以下连续步骤获得在低蛋白质条件下制备的病毒样品，在合适的缓冲液中浓缩病毒样品，在病毒样品中沉淀病毒以及对沉淀的病毒进行色谱精制，从而生产高纯度病毒。在一个实施例中，高纯度病毒是高纯度病毒母液。在一个实施例中，高纯度病毒或高纯度病毒母液具有低于50ug/ml的蛋白质浓度。在另ー个实施例中，高纯度病毒或高纯度病毒母液具有低于100fg/TCID5(l的蛋白质浓度。在一个实施例中，高纯度病毒或高纯度病毒母液具有低于60fg/TCID5(l的蛋白质浓度。在另ー个实施例中，高纯度病毒或高纯度病毒母液具有低于50fg/TCID5(l的DNA浓度。在一个实施例中，高纯度病毒或高纯度病毒母液具有低于15fg/TCID5(l的DNA浓度。在另ー个实施例中，高纯度病毒或高纯度病毒母液具有低于100fg/TCID5(l的蛋白质浓度和低于50fg/TCID5(l的DNA浓度。在一个实施例中，高纯度病毒或高纯度病毒母液具有低于60fg/TCID5(l的蛋白质浓度和低于15fg/TCID5(l的DNA浓度。 在另ー个实施例中，高纯度病毒或高纯度病毒母液具有至少IO6TCID5cZml的病毒浓度。本专利技术的另ー个实施例是ー种评估和/或验证病毒清除处理和其中所用物质的方法。縮尺病毒清除处理是通过使用测试样品和分析病毒清除处理的结果来测试。病毒清除的量评估并且决定着病毒清除处理以及病毒清除处理中所用物质的验证。如果病毒充分地从测试样品中去除来满足管理标准，那么病毒清除处理以及清除处理中所用物质经过验证。在一个实施例中，评估和/或验证病毒清除处理的方法包含向样品中掺加高纯度病毒母液，以生产测试样品。在一个实施例中，高纯度病毒溶液包含低于100fg/TCID5(l的蛋白质浓度和低于50fg/TCID5Q的DNA浓度。本专利技术的另ー个实施例是在包含向样品中掺加病毒溶液的方法中评估和/或验证病毒清除处理的ー种方法，其中病毒溶液是通过包含流通色谱、基于珠粒的色谱、分子排阻处理或基于疏水性的处理的方法来制备。在一个实施例中，病毒溶液是通过阳离子交換流通色谱来制备。在另ー个实施例中，病毒溶液是通过阴离子交換流通色谱来制备。在一个实施例中，流通色谱包含在膜或基于珠粒的基质上的阳离子交換流通色谱。在一个实施例中，评估和/或验证病毒清除处理和其中所用物质的方法包含向样品中掺加高纯度病毒母液，所述病毒母液包含至少107TCID5(l/ml的病毒、低于100fg/TCID5Q的蛋白质浓度和低于50fg/TCID5(l的DNA浓度。附图说明图I是概括的病毒生产方案和特异性小鼠微小病毒(MVM)生产方法的一个实例的方框图。图2是展示本专利技术的一个实施例的流程图。图3A到图3C说明本专利技术的一个实施例。图3A是在样品病毒制备方法中的不同阶段取出的样品的银染色SDS-PAGE凝胶。泳道1、14和15是标准分子量标记。泳道2是在第3天的MVM感染的细胞培养基的样品，紧接着将所述培养基从具有1%胎牛血清(FBS)的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)改变成无血清的DMEM。泳道3是在第14天感染完成时混合细胞裂解液的样品。泳道4是澄清裂解液的样品。泳道5是来自用于病毒浓缩的超滤(Centricon )的滤液样品。泳道6是来自用于病毒浓缩的超滤的稀释过的滞留物样品。泳道7是在通过超速离心进行病毒沉淀后的上清液样品。泳道8是在通过超速离心进行病毒沉淀后的病毒颗粒样品。泳道9是在通过超速离心进行病毒沉淀和经过O. 22微米过滤器过滤后的病毒颗粒样品。泳道10和12是使用阳离子交換(CEX)膜吸附剂进行色谱精制时的早期部分的样品，所述阳离子交換(CEX)膜吸附剂包含通过聚醚砜(PES)基质上的MBAm (N, N’ -亚甲基双丙烯酰胺)交联的AMPS (2-丙烯酰胺基-2-甲基-I-丙磺酸)。泳道11和13是使用CEX膜吸附剂进行色谱·精制时的后期部分。图3B由维尔王(Willwand)等人，病毒学杂志(J Virol) (1993) 67:5660改编而来，其展示MVM衣壳蛋白VPl的分子大小是83kDa并且MVM衣壳蛋白VP2的分子大小是64kDa。在最终纯化过的病毒产品(图3A)中通过银染色SDS-PAGE明显可见的两个主要蛋白色带具有与已知MVM病毒壳体蛋白VPl和VP2相同的大小并以相同的比例呈现，这表明极纯病毒母液中主要残留蛋白是病毒而非杂质。图3C是对应于图3A中的SDS-PAGE凝胶的泳本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：戴蒙·R·亚瑟，亚曼达·B·卡兹，纳维德·Z·坎恩，乌许玛·梅塔，
申请(专利权)人：EMD密理博公司，
类型：
国别省市：
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