一种重组虎纹克胰肽载体及其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及一种重组虎纹克胰肽载体及其制备方法和用途。重组虎纹克胰肽载体包括1或1个以上拷贝虎纹克胰肽，虎纹克胰肽的碱基序列如SEQ?ID?NO:9所示。其制备方法为：获得虎纹克胰肽基因；以获得的虎纹克胰肽基因为模板，进行扩增，酶切，连接，得到1个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体；将1个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体进行酶切连接，再以连接产物为扩增模板，进行第二次扩增，所得到的扩增产物与载体双酶切后进行连接得到2个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体；重复上述步骤，依次得到2个以上拷贝数的虎纹克胰肽重组载体。本发明专利技术的重组虎纹克胰肽载体表达量高、制备方法简单，与天然提取的虎纹克胰肽在生物活性上无明显差异。

【技术实现步骤摘要】
一种重组虎纹克胰肽载体及其制备方法和用途
本专利技术涉及基因工程技术，尤其涉及一种重组虎纹克胰肽载体及其制备方法和用途。
技术介绍
胰蛋白酶抑制剂是一种抑制丝氨酸蛋白酶活性的蛋白质或其他分子，在体内调控很多重要的生理过程，是维持体内环境稳定的重要因素；胰蛋白酶抑制剂的来源广泛，抗原性相对较弱，毒性低。因此，胰蛋白酶抑制剂在疾病的临床诊断、治疗等方面有广阔的应用前景，广泛应用于急性胰腺炎、外科手术、脑血管疾病、妇产科疾病、休克以及抗肿瘤治疗。虎纹克胰肽，即虎纹捕鸟蛛蛋白酶抑制剂(HWTX-XI)，是第一个从蜘蛛毒素中分离的具有Kunitz型结构模体的胰蛋白酶抑制剂，是至今为止发现的胰蛋白酶抑制活性最强的天然多肽，其抑制活性比BPTI高两个数量级(BPTI即牛胰蛋白酶抑制剂，或称为抑肽酶， aprotinin，被广泛的应用于临床)，而且HWTX-XI具有较高的稳定性、没有明显毒性和易于基因工程表达等优势，表明HWTX-XI在治疗与胰蛋白酶相关的疾病中有较好的应用前景。目前天然虎纹克胰肽的来源有限，故急需一种能高效生产虎纹克胰肽且活性与天然虎纹克胰肽一致的方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种高效生产虎纹克胰肽的重组载体。该重组载体包括I个或I个以上拷贝的虎纹克胰肽的重组载体，所述虎纹克胰肽的碱基序列如SEQ IDNO: 9 所示。为实现上述目的，本专利技术提供一种重组虎纹克胰肽载体的制备方法，包括如下步骤，获得虎纹克胰肽基因；具体为得到成熟虎纹克胰肽的原始碱基序列；再通过引物引入突变位点，扩增得到突变的虎纹克胰肽基因序列。所述引物还引入了切割位点序列。切割位点序列为根据密码子规则编码的氨基酸序列，优选地，所述切割位点序列编码单个氨基酸或两个氨基酸或6个氨基酸，更优选地，单个氨基酸为R或W或M或D或E或K ;两个氨基酸为D-P或N-G ;三个氨基酸为R-K-R或R-R-R ；6个氨基酸为L-V-P-R-G-S。获得I个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体以获得的虎纹克胰肽基因为第一次扩增模板，进行第一次扩增，双酶切，与重组载体连接，得到I个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体；优选地，还可以包括以下步骤，获得2个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体将I个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体进行双酶切，回收小片段，加入酶后连接，再以连接产物为扩增模板，进行第二次扩增，所得到的扩增产物与载体双酶切后进行连接得到2个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体；优选地，还可以重复上述步骤，依次得到2个以上拷贝数的虎纹克胰肽重组载体。所述切割位点序列可被化学试剂或酶切割，优选地，化学试剂为溴化氰、甲酸或羟胺，酶试剂为胰蛋白酶、梭菌蛋白酶、弗林蛋白酶、凝血酶或亮氨酸氨肽酶。所述获得I个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体为，以所述虎纹克胰肽基因为第一次扩增模板，使用含有一定双酶切位点的引物进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物进行双酶切，与同样双酶切的载体连接得到重组载体，即为I个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体；所述获得2个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体为将所得的I个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体双酶切后回收小片段，加入用于双酶切的两个酶，T4连接酶进行连接，得到连接产物；以所得的连接产物为模板，进行扩增，将扩增产物回收小片段，与载体双酶切后进行连接得到2个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体。所述载体为可在原核表达系统中或真核表达系统中进行表达，优选地，原核表达系统为PET系统、pGEX系统或pMAL系统，所述真核表达系统为pPIC9K系统、pCMVp系统、 pEGFP系统、pEGFT系统、pSV2系统或CMV4系统。本专利技术还保护虎纹克胰肽重组载体或根据所述方法制备的虎纹克胰肽重组载体用于制备药物的用途。本专利技术提供的方法具有如下设计方案I、从Genebank数据库获得HWTX-XI基因编码区碱基序列，设计HWTX-XI上下游引物，使用PCR方法从虎纹捕鸟蛛毒腺中获得HWTX-XI基因。本专利技术的HWTX-XI基因序列或氨基酸序列也可以人工合成获得。2、设计的HWTX-XI突变体与野生的虎纹克胰肽相比，有一个氨基酸序列的变动， 并且在末尾处多出一个氨基酸。3、设计的HWTX-XI引物具有如下特征编码链和模板链的5’端上游及3’端下游含有具有同尾酶特性的不同的酶切位点，使得每个HWTX-XI基因片段之间可以头尾相连， 头头或尾尾相连的片段可以经由同尾酶进行消化。4、在HWTX-XI基因的5’端上游序列引入切割位点序列，切割位点序列具有如下特征根据密码子规则编码的氨基酸序列可被化学试剂或酶切割。优选的，所述切割位点序列编码为单个氨基酸或两个氨基酸或6个氨基酸，确切的，单个氨基酸为R或W或M或D或E 或K ;两个氨基酸为D-P或N-G ;三个氨基酸为R-K-R或R-R-R ；6个氨基酸为L-V-P-R-G-S。 所述的英文大写字母为氨基酸的代码，比如R表示精氨酸，W表示色氨酸，M表示甲硫氨酸， D表示天冬氨酸，E表示谷氨酸，P表示脯氨酸，N表示天冬酰氨，G表示甘氨酸，K表示赖氨酸，L表示亮氨酸，V表示缬氨酸，S表示丝氨酸。遵守20种氨基酸的密码子表。6、所述多拷贝构建体亚克隆至原核表达载体或真核表达载体中形成原核表达构建体或真核表达构建体。所述构建体可在原核表达系统中或真核表达系统中进行表达，所述原核表达系统包括PET系统、pGEX系统、pMAL系统等，所述真核表达系统包括pPIC9K系统、pCMVp系统、pEGFP系统、pEGFT系统、pSV2系统、CMV4系统等，不排除其他原核或真核表达系统。7、所述原核或真核表达产物可被化学试剂或酶切割，获得纯化的HWTX-XI重组蛋白，确切的，化学试剂包括，但不限于溴化氰、甲酸和羟胺，酶试剂包括胰蛋白酶(Trypsin)、 梭菌蛋白酶(Clostripain)、弗林蛋白酶(Furin)、凝血酶(Thrombin)和亮氨酸氨肽酶 (Leucine aminopeptidase)。8、所述纯化后的HWTX-XI重组蛋白，采用滴定法测定比活性，具有显著生物活性，与天然提取的虎纹克胰肽无明显差异。附图说明图I为虎纹克胰肽空间结构图。图2为虎纹克胰肽突变体菌液PCR的电泳图。图3为虎纹克胰肽定向多拷贝克隆PCR的电泳图。图4为虎纹克胰肽的定向多拷贝克隆pMD 19-T质粒EcoR I/sal I双酶切电泳图。图5为虎纹克胰肽定向多拷贝克隆经DNAMAN的序列比对图。图6为虎纹克胰素1-6串联表达载体EcoR I/Not I双酶切鉴定图。图7单拷贝重组虎纹克胰素的Tricine-SDS-PAGE分析结果图。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例I :定向多拷贝表达方法高效生产重组HWTX-XII :采用PCR方法从虎纹捕鸟蛛毒腺中获取HWTX-XI基因采用TRIzol法从虎纹捕鸟蛛毒腺(蒋立平博士学位论文，虎纹捕鸟蛛毒素的基因克隆、表达及功能研究，2008年11月，湖南师范大学生命科学学院)中快速提取总R本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种虎纹克胰肽重组载体，包括1个或1个以上拷贝的虎纹克胰肽的重组载体，所述虎纹克胰肽的碱基序列如SEQ?ID?NO:9所示。

【技术特征摘要】
1.一种虎纹克胰肽重组载体，包括I个或I个以上拷贝的虎纹克胰肽的重组载体，所述虎纹克胰肽的碱基序列如SEQ ID N0:9所示。2.一种制备权利要求I所述虎纹克胰肽重组载体的方法，其特征在于，包括如下步骤， 获得虎纹克膜妝基因； 获得I个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体以获得的虎纹克胰肽基因为第一次扩增模板，进行第一次扩增，双酶切，与重组载体连接，得到I个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体； 优选地，还可以包括以下步骤，获得2个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体将I个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体进行双酶切，回收小片段，加入酶后连接，再以连接产物为扩增模板，进行第二次扩增，所得到的扩增产物与载体双酶切后进行连接得到2个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体； 优选地，还可以重复上述步骤，依次得到2个以上拷贝数的虎纹克胰肽重组载体。3.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述获得虎纹克胰肽基因为得到成熟虎纹克胰肽的原始碱基序列；再通过引物引入突变位点，扩增得到突变的虎纹克胰肽基因序列。4.根据权利要求3的方法，其特征在于，所述引物还引入了切割位点序列。5.根据权利要求4的方法，其特征在于，切割位点序列为根据密码子规则编码的氨基酸序列，优选地，所述切割位点序列编码单个氨基酸或两个氨基酸或6个氨基酸，更优选地，单个氨基酸为R或W或M或D或E或K ;两个氨基酸为D-P或N-G ;三个氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：任宏伟，凡复，林昳，郑和东，郑宇，
申请(专利权)人：厦门北大之路生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：