极暗黄链霉菌制造技术

一种极暗黄链霉菌（Streptomyces?fulvissimus）CZB40，2012年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC?NO：M2012519。本菌株对农作物病具有广谱拮抗作用，对辣椒疫霉病菌、桃树褐腐病菌、及水稻稻瘟病菌有较好的抑制作用，对水稻纹枯病菌的抑制效果尤为明显。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种微生物
，具体指一种对农作物病具有广谱拮抗作用，尤其对水稻纹枯病具有明显抑制作用的极暗黄链霉菌(Streptomyces fulvissimus) CZB40。
技术介绍
水稻纹枯病是由立枯丝核菌(Rhzioeotniasoalni)引起的导致水稻减产的重要病害，可造成10%_30%的产量损失，发病严重时减产可达50%。近几年，随着高产杂交稻品种的推广，施氮水平的提高，水稻复种指数的上升，水稻纹枯病的危害越来越严重。目前我国水稻纹枯病的防治主要以井R霉素与一些化学药剂为主，长期单一使用井R霉素易导致立枯丝核菌产生抗药性，近年井R霉素每季用药次数已从20年前2次增加到现在的3-5次， 用药量也从I. 5 kg/hm2上升到4. 5-6. Okg/hm，而化学药剂存在毒性、残留、环境污染等缺点，且由于立枯丝核菌腐生能力强和寄主范围广的特点，国内外至今尚未发现对该病的高抗品种。且，随着化学杀菌剂对生态环境、有益生物及人体所引致负作用的加大，以及植物病原菌日益增加的抗药性，利用一些生物防治菌作为生物杀菌剂来防治植物病害，以减轻化学农药对环境污染的研究引起各界的密切关注。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种对农作物病具有广谱拮抗作用的极暗黄链霉菌(Streptomyces fulvissimus) CZB40,尤其对水稻纹枯病菌具有良好的抑制效果。本专利技术所述的极暗黄链霉菌(Streptomyces fulvissimus)CZB40,已于2012年12 月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO :M2012519，保藏地址中国武汉武汉大学。本专利技术菌株CZB40具有以下性质形态特征使用插片法在高氏I号培养基上28°C培养7d后，分别用光学显微镜和电子显微镜观察发现，本菌株具有典型的链霉菌属特征，菌落紧密、表面皱折，皮壳状，青褐色。气生菌丝和基内菌丝均很丰富，在扫描电镜下观察发现，气生菌丝体形成孢子链时，孢子丝呈螺旋状，孢子呈短圆柱形，见图I。生理生化特性本专利技术菌株CZB40在高氏一号固体培养基中生长产生暗黄色色素。本菌株能分解利用纤维素，使明胶液化，使淀粉水解，能使牛奶胨化，但不能使牛奶凝固，也不能产生硫化氢。利用参照I. M. Kauffmann等及Jasmina Nikodinovic等的方法提取本专利技术菌株的基因组DNA，根据放线菌16SrDNA的结构特点及其保守区设计特异引物(引物由上海生工生物工程公司合成)正向引物16sF AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (见 SEQ ID NO. I)；反向引物16sR AAGGAGGTGATCCAGCCGCA (见 SEQ ID NO. 2)。以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增(50 μ L反应体系)94°C预变性5min， 94°C变性Imin，56°C复性Imin，72°C延伸2min，25个循环，72°C延伸8min。扩增产物经上海生工生物工程技术有限公司测序,序列经BLAST分析并构建系统发育树(见图2)表明，本专利技术菌株CZB40与极暗黄链霉菌(Streptomyces fulvissimus)的相似性达99%。结合形态和生理生化特征分析，将其鉴定为极暗黄链霉菌(Streptomyces fulvissimus)的一个新种， 命名为极暗黄链霉菌(Streptomyces fulvissimus) CZB40。培养及发酵条件培养基中的营养源并无特殊的规定，培养基中可含有常用于微生物培养的碳源、 氮源及其他营养源。其中，碳源可为葡萄糖、麦芽糖、马铃薯淀粉、可溶性淀粉、玉米粉、大米粉、蔗糖等。氮源可为NaN03、(MM)2SO4、酵母粉、蛋白胨、大豆粉等。其他营养源可为含镁、 钠、钾之类的金属盐等。对温度、时间等培养条件并无严格的限制，以适于本专利技术菌株的生长为宜。将本专利技术菌株CZB40接种于发酵培养基中，可获得发酵液，发酵培养基为玉米粉 10-30g、酵母粉 3-7g、MgSO4 O. 2_lg、NaCl O. 2_lg、K2HP O4 O. 2_lg、1000ml 水，pH 5-9 ； 发酵条件为接种量1-10% (体积)、温度26-30°C、摇瓶转速150-250r/min、发酵培养时间为48-96h。通过单因素试验和均匀设计法对本专利技术菌株CZB40的发酵培养基和发酵条件进行优化，得到最佳培养基(1000ml水)为25g玉米粉、5g酵母粉、O. 2g MgSO4、0. 8gNaCl、 O. 4gK2HP04 pH 6 ;最佳发酵条件为接种量5%、温度29°C、转速200r/min、发酵时间72h。本专利技术菌株对农作物病具有广谱拮抗作用，对辣椒疫霉病菌、桃树褐腐病菌、及水稻稻瘟病菌有较好的抑制作用，尤其对水稻纹枯病菌抑制效果明显。附图说明图I是本专利技术菌株CZB40的孢子形态图。图2是本专利技术菌株的系统发育树。具体实施方式下面以具体实施例对本专利技术作进一步说明，本文中提及的各病原菌均由湖南农业大学植物病理系提供。实施例I将从湖南省郴州市采集的土样于室温下风干，称取土样IOg放入盛有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡20min，用无菌移液管从中吸取Iml 土壤悬液注入盛有9ml 无菌水的试管中，混匀。从此试管中吸取Iml注入另一支盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制备10 -2、10 -3、10 —4、10 —5、10 —6的土壤稀释液。用无菌移液管吸取10 -2、10 -4、10 -6 稀释液O. ImL分别滴加到加有3%的抑菌剂(K2Cr2O7)的培养基平板上，用无菌涂布棒涂匀， 静置30min后,将培养皿放在28°C温箱中倒置培养。及时挑单菌落至高氏一号培养基上划线纯化，得到本专利技术菌株。其中，添加有3%的抑菌剂(K2Cr2O7)的培养基配方为可溶性淀粉20g、KNO3 lg、 K2HPO4 O. 5g、MgS04.7H20 0. 5g、NaCl 0. 5g、FeSO4. 7H20 0. Olg、琼月旨 20g、水 lOOOmL、pH7. 2，加入的抑菌剂(K2Cr2O7) 3mL。实施例2将本专利技术菌株CZB40接种5% (体积)于发酵培养基(玉米粉25g、酵母粉5g、MgSO4 0.2g、NaCl O. 8g, K2HP O4 O. 4g、1000ml 水；pH6)，28°C 下以 200r/min 转速摇瓶发酵培养 72h，用细菌过滤器(直径=0. 22 μ m)过滤，得发酵液。实施例3本专利技术菌株对水稻纹枯病菌的抑制作用于培养皿中加入3ml本专利技术菌株发酵液与12mlPDA，混匀制成平板(以3ml无菌水与12mlPDA混匀制成平板做对照)，将培养在PDA上的水稻纹枯病菌的小菌饼(直径=5mm) 倒置放到平板中央，重复3次。静置Ih后放入28°C温箱倒置培养l-2d。用十字交叉法测量抑菌圈直径，并观察抑菌圈透明程度和边缘整齐程度，记录结果并按下式计算抑制率菌落直径=相垂直的两直径的平均值一菌饼直径抑制率(％)=(对照菌落直径一处理菌落直径)/(对照菌落直径一菌饼直径)X 100%。(这里提及的菌饼直径皆是指水稻纹枯病菌的小菌饼(直径=5mm))结果表明本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种极暗黄链霉菌，其特征在于：该菌株为极暗黄链霉菌（Streptomyces?fulvissimus）CZB40，2012年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC?NO：M2012519。

【技术特征摘要】
1.一种极暗黄链霉菌，其特征在于该菌株为极暗黄链霉菌(Streptomycesfulvissimus)CZB40，2012年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO M2012519o2.一种发酵法制备极暗黄链霉菌发酵液的方法，其特征在于发酵所用菌株为权利要求I所述的极暗黄链霉菌CZB40，发酵培养基为玉米粉10-30g、酵母粉3-7g、MgSO4O.2-lg、NaCl O. 2_lg、K2HP O4 O. 2_lg、水 1000ml，pH 5-9 ;发酵条件为接种量 1_10%、温度26-30°C、摇瓶转速150-250r/min、发酵培...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱宏建，刘双清，周清明，何龙，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：