本发明专利技术提供了一种基于微流控芯片的体外血脑屏障模型的建立与表征方法，该微流控芯片主要包括细胞入口池(1)、胶原入口池(2)、细胞培养室(3)和废液池(4)，细胞培养室(3)上连细胞入口池(1)，细胞培养室(3)下连废液池(4)，每个胶原入口池分别含有4个观察小室，胶原入口池与细胞培养室(3)联通。本发明专利技术将体外血脑屏障模型的构建与表征、屏障功能的评价集成到一块几平方厘米的芯片上，可以用于血脑屏障模型的体外模拟及后续应用。本发明专利技术与Transwell小室细胞共培养模型相比，解决了细胞共培养模型二次接种和耗时长的问题，添加入流动条件，更接近体内真实微环境，而且显著降低了细胞和试剂消耗量，并可以单次同时获得多个实验相关参数。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及将微流控芯片技术应用到体内组织工程的模拟与应用领域，具体涉及一种。
技术介绍
1885年德国人PaulEhrlich第一次证明了脑血管的通透性与非神经性血管不同，其后的研究者们相继认识到血和脑之间有屏障存在，并称之为血-脑屏障。血脑屏障是一个以脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞共同构成的结构的和功能的屏障，它调节分子进出大脑以维持神经的微环境。很多脑内的疾病都与血脑屏障的防御功能被破坏有关，药物又无法顺利通过血脑屏障。因此，建立体外血脑屏障模型，研究血脑屏障的结构和功能特性、对各种化学成分的转运能力及其损伤和防御功能被破坏的机制，对于进一步研究血脑屏障的功能原理，认识脑部感染和药物的转运机制，以及由于屏障功能失效造成的脑损伤和疾病和如何进行药物治疗有着重大意义。细胞生物学发展至今,主要的培养和研究依赖于的是孔板和商品化的Transwell小室，集中观察单一或者多种因素刺激下的细胞形态变化、生长过程、迁移和增殖行为等。现有的体外血脑屏障的模拟方法主要集中于商品化的孔板或Transwell小室，研究二维层面血脑屏障模型的结构和功能，主要存在的问题是孔板或者Transwell小室很难在体外构建存在二维平面到三维空间的界面转换的血脑屏障模型，难以实现间充质干细胞穿越血脑屏障进行脑内肿瘤治疗的原位观察。微流控芯片技术作为一门迅速发展起来的科学技术，已经在生物医学领域展现了其独特的优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、在时间和空间维度上能够提供更为精确的操控，易于通过灵活设计实现多种细胞功能研究等特点而成为新一代细胞研究的重要平台。它对于实验结果能够实时追踪和原位观察，不仅能够获得最终结果，也可以得到细胞迁移过程中出现的暂时性信息，为间充质干细胞穿越血脑屏障过程的研究提供常规分析中有可能缺失的重要生物学信息。而目前，利用微流控芯片进行间充质干细胞穿越血脑屏障，尤其是从二维平面迁移运动到三维基质过程的研究分析还处于空白阶段。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于微流控芯片的血脑屏障模型的建立与表征方法，该方法能够实现观测血脑屏障形成过程中的结构和功能的变化。本专利技术提供了一种微流控芯片，该微流控芯片主要由细胞入口池(I)、胶原入口池(2)、细胞培养室(3)和废液池(4)组成；细胞培养室(3)上连细胞入口池(I)，细胞培养室(3)下连废液池(4)，每个胶原入口池分别含有4个观察小室，胶原入口池利用不同高度液体表面张力的差异与细胞培养室(3)联通。本专利技术提供的微流控芯片，所述微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为可透光透气的PDMS聚合物，下层材料为浓硫酸煮过的洁净玻璃。本专利技术提供的微流控芯片，所述微流控芯片的上下两层分别进行紫外过夜照射的灭菌处理，然后等离子体处理30-45S进行封接。本专利技术提供的微流控芯片，所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成(I)、⑶、⑷的高度约为⑵高度的三倍；其中，⑴、⑶、⑷的高度为150 iim，⑵的高度为50 u m0本专利技术还提供了一种基于所述微流控芯片的血脑屏障模型的建立和表征方法，方法过程如下(I)脑胶质瘤细胞条件培养液的制备将脑胶质瘤细胞消化后，以一定浓度接种入6孔板，恒温培养箱中培养24-36小时之后，弃去培养液，向孔板中加入无血清细胞培养液，恒温培养箱中继续培养48小时，收集该培养液备用；(2)芯片内胶原的灌注用移液器将配制好的胶原工作液注入胶原入口池(2)，将固定芯片的培养皿放入恒温培养箱中孵育30-45分钟，促使通道内胶原由粘稠状液体变为果冻状凝胶，凝胶结束后，细胞入口池(I)、细胞培养室(3)和废液池(4)中加入新鲜的细胞培养液；(3)芯片内细胞接种及血脑屏障模型的建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)经消化后，调整细胞密度为5X106-lX107Cells/mL，取10-20 ii L细胞悬液加入细胞入口池(I)内，从废液池端迅速吸出10-20ii L细胞培养液，促使细胞在重力流的作用下快速、均匀地进入细胞培养室(3);当在光学显微镜下观察到细胞培养室(3)中的细胞均匀分布时，立即将芯片竖立，并移入恒温培养箱中放置，竖立方向为细胞培养室(3)在上，胶原入口池(2)在下；竖立放置8min后，取出观察，如果细胞紧贴于细胞观察室交界面，说明细胞接种成功；将芯片放平，向通道加入先前收集的脑胶质瘤细胞的条件培养液，移入恒温培养箱中继续培养48-60小时，每隔12-24小时换液一次；(4)血脑屏障模型的结构表征及功能评价常规免疫荧光染色法表征模型细胞表面紧密连接蛋白的表达；以小分子(MW=557. 47)荧光物质为探针，表征血脑屏障模型的渗透性，向细胞入口池(I)内加入小分子荧光物质溶液，分别测定0min、15min、30min后胶原入口池的4个观察室内的荧光强度。本专利技术提供的基于微流控芯片的血脑屏障模型的建立和表征方法，血脑屏障模型建立时，应用脑胶质瘤细胞的条件培养液对内皮细胞进行刺激，使其形成类似血脑屏障的细胞间紧密连接。本专利技术提供的基于微流控芯片的血脑屏障模型的建立和表征方法，所述胶原为I型鼠尾胶原，常温下它是呈粘稠状的液体，当pH=7，温度达到37°C的情况下，孵育30min，即可呈现果冻状的凝胶。本专利技术提供的基于微流控芯片技术的血脑屏障模型的建立和表征方法，血脑屏障结构和功能的表征可采用生物学上常用的细胞检测手段对血脑屏障模型细胞进行检测，包括常规细胞免疫荧光染色。本专利技术将体外血脑屏障模型的构建与表征、屏障功能的评价集成到一块几平方厘米的芯片上，可以用于血脑屏障模型的体外模拟及后续应用。本专利技术与Transwell小室细胞共培养模型相比，解决了细胞共培养模型二次接种和耗时长的问题，添加入流动条件，更接近体内真实微环境，而且显著降低了细胞和试剂消耗量，并可以单次同时获得多个实验相关参数。附图说明图I本专利技术微流控芯片整体结构示意图；其中，黑色区域的芯片高度为150i!m，灰色区域的芯片高度为50iim;图2微流控芯片胶原加入后形成的二维平面与三维基质的清晰界面及三维基质均匀胶丝；图3芯片细胞接种后竖立IOmin时的细胞对三维基质胶的贴附情况； 图448小时之后血脑屏障的形成情况；图5细胞间紧密连接蛋白ZO-I的表达情况，其中，a显示的为160倍放大条件下，ZO-I蛋白的表达情况，b为a图的局部放大效果图；图6血脑屏障渗透性表征，其中，a显示的为小分子荧光物质渗透的实时监测图，b显示的为a图渗透性的数据统计，说明随时间的延长，渗透过血脑屏障模型的荧光物质的量变增大。具体实施例方式下面的实施例将对本专利技术予以进一步的说明，但并不因此而限制本专利技术。实施例IHUVEC细胞在三维胶原表面紧密融合形成血脑屏障及结构表征利用实验室自行设计制作的微流控芯片，构型如图I所示。配制浓度为3mg/mL的胶原原液，按每孔0. L加入到胶原入口池中，37°C凝胶30min，形成的胶丝分布如图2所示。从细胞入口池加入HUVEC细胞悬液10-20 iiL，细胞悬液浓度为5X IO6-IX IO7Cells/mL,竖立芯片lOmin，使细胞贴附在胶原一侧，如图3所示，拍照记录细胞初始位置。每隔24h换液一次，并拍照记录HUVEC细胞融合情况，如图4所示。48小时后，进行本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种微流控芯片，其特征在于：该微流控芯片主要包括细胞入口池(1)、胶原入口池(2)、细胞培养室(3)和废液池(4)；细胞培养室(3)上连细胞入口池(1)，细胞培养室(3)下连废液池(4)，每个胶原入口池分别含有4个观察小室，胶原入口池与细胞培养室(3)联通。
【技术特征摘要】
1.一种微流控芯片，其特征在于该微流控芯片主要包括细胞入口池(I)、胶原入口池(2)、细胞培养室(3)和废液池(4);细胞培养室(3)上连细胞入口池(I)，细胞培养室(3)下连废液池(4)，每个胶原入口池分别含有4个观察小室，胶原入口池与细胞培养室(3)联通。2.按照权利要求I所述的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为可透光透气的PDMS聚合物，下层材料为浓硫酸煮过的洁净玻璃。3.按照权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片的上下两层分别进行紫外过夜照射的灭菌处理，然后等离子体处理45-60S进行不可逆封接。4.按照权利要求I所述的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成，细胞入口池(I)、细胞培养室(3)、废液池(4)高度为胶原入口池(2)高度的三倍。5.按照权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于所述胶原入口池(2)高度约为50iim;细胞入口池(I)、细胞培养室(3)、废液池(4)高度为150 iim。6.一种基于权利要求I所述的微流控芯片的血脑屏障模型的建立与表征方法，其特征在于方法过程如下 (1)脑胶质瘤细胞条件培养液的制备 将脑胶质瘤细胞消化后，以5 X IO5-I X IO6ceIlsAiL密度接种入6孔板，恒温培养箱中培养24-36小时之后，弃去培养液，向孔板中加入无血清细胞培养液，恒温培养箱中继续培养48小时，收集该培养液备用； (2)芯片内胶原的灌注 用移液器将配制好的胶原工作液注入胶原入口池(2)，将固定芯片的培养皿放入恒温培养箱中孵育30-45分钟，促使通道内胶原由粘稠状液体变为果冻状凝胶，凝胶结束后，细胞入口池(I)、细胞培养室(3)和废液池(4)中加入新鲜的细胞培养液； (3)芯片内细胞接种及血脑屏障模型的建立 人脐静...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦建华，许慧，马慧朋，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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