本发明专利技术公开了细胞色素结合结构域蛋白作为助分泌因子提高外源蛋白在毕赤酵母中分泌的用途。将细胞色素结合结构域蛋白编码基因按毕赤酵母密码子偏好进行优化并与外源基因进行融合得到融合基因，将融合基因转化到毕赤酵母中进行分泌表达能显著提高外源基因在毕赤酵母中的分泌表达量。由此，本发明专利技术提供了细胞色素结合结构域蛋白作为助分泌因子或其编码基因作为助分泌基因的新用途。此外，融合有细胞色素结合结构域蛋白编码基因的融合基因所表达的融合蛋白在分泌出毕赤酵母细胞外的过程中能被KeX2蛋白酶切割成野生型蛋白质和细胞色素结合结构域蛋白质，使外源蛋白质的N端不增加额外的序列，不影响分泌蛋白质的理化性质。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞色素结合结构域蛋白及其编码基因的新用途，尤其涉及细胞色素结合结构域蛋白及其编码基因作为助分泌因子或助分泌基因以提高外源基因在毕赤酵母中分泌表达量中的新用途，属于细胞色素结合结构域蛋白或其编码基因的用途领域。
技术介绍
毕赤酵母(Pichia pastoris)是单细胞真核生物，既有类似原核生物的生长特征， 又有一般真核生物的细胞生物学特性，是目前最成功的外源基因真核表达系统。毕赤酵母表达系统具有易于操作培养，高密度发酵水平很高，表达菌株稳定，正确翻译和翻译后加工修饰更接近于高等真核生物等优点。除此之外毕赤酵母极少分泌自身蛋白，在其培养液中除目的蛋白外，几乎不含任何其它蛋白，这样就使得目的蛋白的纯化变得非常简单，而且许多外源基因的分泌表达量可达到每升克级以上，因此利用该系统可以极大的降低目的蛋白的生产成本。但是，如果目的蛋白不能分泌到胞外，其产量一般不会高于细胞总蛋白量的 1%，并且目的蛋白的纯化将变得非常复杂，蛋白质的生产成本自然也会非常高。因此尽管科研人员非常希望利用毕赤酵母高效分泌表达外源基因，然而到目前为止仍然有许多基因 (尤其是那些在原始菌或细胞中不分泌表达的基因)不能在毕赤酵母中分泌表达或分泌表达量非常低，这个问题也成为限制该表达系统更广泛应用的一个关键因素。有研究发现若蛋白在毕赤酵母中表达但不分泌，可以通过在蛋白质N端融合一些蛋白质标签来，表达提高目的蛋白的分泌量。已有的助分泌因子主要有谷胱甘肽转移酶 (glutathione-S-transf erase, GST),绿色突光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP), 硫氧还蛋白(thioredoxin),泛素(ubiquitin),纤维素结合结构域(cellulose binding domain, CE )，翻译起始因子 IF2 的 Domainl,绿色突光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)以及来源于大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)。这些蛋白质标签可以提高一些特定蛋白质在毕赤酵母中的分泌量。细胞色素结合结构域蛋白(Cytochromes heme binding domain, CHBD)为蛋白质细胞色素b5 (cytochrome b5)中N端的一部分(N端100个氨基酸)。该蛋白质广泛存于高等动物内质网膜，具有分子量小、可溶性大、稳定性高等优点，作为电子传递蛋白，可参与生物体组织中一系列重要的氧化还原反应，如脂质和类固醇的合成代谢等。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供细胞色素结合结构域蛋白的一种新用途；本专利技术的另外一个目的是提供一种提高外源基因在毕赤酵母中分泌表达量的方法。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的本专利技术通过试验发现，将细胞色素结合结构域蛋白(CHBD)编码基因(SEQ IDNo. I)与外源基因进行融合并转化到毕赤酵母中进行分泌表达，能有效提高外源基因在毕赤酵母中的分泌表达量。进一步的，本专利技术将细胞色素结合结构域蛋白编码基因通过密码子优化、提高mRNA 二级结构的稳定性等措施得到优化的细胞色素结合结构域蛋白编码基因(CHBD-O) (SEQ ID No. 2)，将该优化的细胞色素结合结构域蛋白编码基因与外源基因进行融合并转化到毕赤酵母中进行分泌表达，能够非常显著的提高外源基因在毕赤酵母中的分泌表达量。由此，可将细胞色素结合结构域蛋白作为助分泌因子或将细胞色素结合结构域蛋白编码基因或优化的细胞色素结合结构域蛋白编码基因作为助分泌基因应用于提高外源基因在毕赤酵母中的分泌表达量。本专利技术按照毕赤酵母的偏嗜性对细胞色素结合结构域蛋白(CHBD)编码基因进行了优化，通过在原始的CHBD或优化后的CHBD-O标签的C端引入能在毕赤酵母中能被KeX2 蛋白酶识别的切割位点(EKREAEA) (SEQ IDNo. 5)，然后再加上外源基因得到融合基因，所表达的融合蛋白在分泌出胞外的过程中能被KeX2蛋白酶切割成野生型蛋白质和CHBD助分泌因子，能够更有效的提高外源基因的分泌表达量；由于该方法在外源蛋白质的N端不增加多余的序列，因而不会影响分泌蛋白质的理化性质。本专利技术通过进一步的研究发现，细胞色素结合结构域作为蛋白标签可以提高许多种蛋白质(如甲基对硫磷水解酶、乳糖酶、葡萄糖氧化酶、木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶等)的分泌表达量，具有较好的应用前景。本专利技术的另一个目的是提供一种提高外源基因在毕赤酵母中分泌表达量的方法， 该方法包括以下步骤将细胞色素结合结构域蛋白编码基因或优化的细胞色素结合结构域蛋白编码基因与外源基因融合在一起，得到融合基因；将融合基因与酵母表达载体可操作性的连接在一起构建得到含有所述融合基因的重组酵母表达载体；将所述重组酵母表达载体转化到毕赤酵母中进行分泌表达。优选的，将将细胞色素结合结构域蛋白编码基因与外源基因融合之前，先将细胞色素结合结构域蛋白的C端引入在毕赤酵母中能被KeX2蛋白酶识别的切割位点 (EKREAEA)，然后再加上外源基因。作为本专利技术一个优选的具体实施方案，本专利技术将细胞色素结合结构域蛋白的C端引入在毕赤酵母中能被KeX2蛋白酶识别的切割位点(EKREAEA)，然后再加上甲基对硫磷水解酶(mph)编码基因，得到融合基因CHBD-O-MPH ;将该融合基因与毕赤酵母表达载体 pPIC9相连接构建得到重组毕赤酵母表达载体pPIC9-chbd-o-mph ;作为对照,本专利技术将甲基对硫磷水解酶基因与毕赤酵母表达载体PPIC9相连接构建得到重组毕赤酵母表达载体 pPIC9-mph ;将所构建的重组毕赤酵母表达载体pPIC9-chbd-o_mph以及pPIC9_mph分别转化到毕赤酵母中进行分泌表达；试验结果发现，没有融合细胞色素结合结构域蛋白基因的 MPH在毕赤酵母表达时分泌量极低，其在毕赤酵母中表达分泌量极低，通过测量50个阳性克隆子，经诱导后其上清平均酶活性为O. 02U/mL。而将助分泌因子(CHBD-O)融合至mph的 N-端后，挑取50个阳性克隆子，经摇瓶诱导培养研究发现，CHBD-O-MPH的毕赤酵母重组菌株经诱导培养基上清平均能达到O. 31U/mL,因此该融合蛋白使MPH的毕赤酵母表达分泌量提高13倍，因此CHBD或CHBD-O助分泌因子可用于提高MPH等外源基因在毕赤酵母中的分泌表达量。此外，融合蛋白表达后在分泌出胞外的过程中能被KeX2蛋白酶切割成野生型蛋白质和CHBD助分泌因子质，外源蛋白质的N端不增加额外的序列，因而不会影响分泌蛋白质的理化性质。附图说明图I对硝基酚含量测定标准曲线。图2重组毕赤酵母表达载体pPIC9-chbd-o_mph、pPIC9-chbd_mph的图谱。图3MPH、融合标签CHBD-MPH、融合标签CHBD-O-MPH毕赤酵母表达初筛菌株诱导上清酶活分布箱须图；1 :毕赤酵母中单独表达MPH的初筛菌株诱导48h后上清酶活分布；2 毕赤酵母中表达MPH的N端融合CHBD的初筛菌株诱导48h后上清酶活分布；3 :毕赤酵母中表达MPH的N端融合优化的CHBD的初筛菌株诱导48h后上清酶活分布；箱外圆圈表示异常值，箱三条横线代本文档来自技高网...
【技术保护点】
细胞色素结合结构域蛋白作为助分泌因子在提高外源基因在毕赤酵母(Pichia?pastoris)分泌表达量中的应用；其中，所述细胞色素结合结构域蛋白的氨基酸序列为SEQ?ID?No.3所示。
【技术特征摘要】
1.细胞色素结合结构域蛋白作为助分泌因子在提高外源基因在毕赤酵母(Pichiapastoris)分泌表达量中的应用；其中，所述细胞色素结合结构域蛋白的氨基酸序列为SEQID No. 3 所示。2.优化的细胞色素结合结构域蛋白编码基因，其特征在于其核苷酸序列为SEQIDNo. 2所示。3.一种融合基因，其特征在于含有SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。4.细胞色素结合结构域蛋白编码基因或权利要求2所述优化的细胞色素结合结构域蛋白编码基因作为助分泌基因在提高外源基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达量中的应用。5.按照权利要求4所述的应用，其特征在于，包括将细胞色素结合结构域蛋白编码基因或优化的细胞色素结合结构域蛋白编码基因与外源基因融合得到融合基因；将融合基因转化到毕赤酵母中进行分泌表达。6.按照权利要求5所述的应用，其特征在于所述的融合是将细胞色素结合结构域蛋白的C端引入能在毕赤酵母中能被KeX2蛋白酶识别的切割位点，然后再加上外源基因；其中，所述切割位...
【专利技术属性】
技术研发人员：田健，伍宁丰，初晓宇，黄璐，王平，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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