产生内源标记的蛋白的方法技术

本公开内容提供了内源标记细胞中的内源蛋白的方法以及包含内源标记蛋白的细胞。本公开内容还描述了利用此类方法产生的细胞和包含具有标记的内源蛋白的细胞的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开内容涉及标记内源蛋白的方法。
技术介绍
蛋白标记广泛用于对细胞中的目标蛋白提供目视读出。在其它用途中，标记蛋白用于研究蛋白丰度和定位、转录调控和翻译调控、翻译后修饰、蛋白-蛋白相互作用、可变剪接、通过RNAi对RNA和蛋白的敲减以及转录因子结合位点。然而，在细胞中表达标记蛋白的目前方法导致失真的表达，其并不反映内源蛋白的表达模式。这是由于标记蛋白的表达往往依赖异源启动子用于表达。此外，一些标记蛋白异位表达自外遗传载体或随机整合至细胞基因组的载体，并因此不受内源调节途径控制。因此，对于可直接特异地整合至细胞的染色体中以产生通过内源调节途径控制的标记蛋白的方法存在强烈的需要。专利技术简沭 在一个方面，本公开内容提供标记至少一种内源蛋白的方法，所述方法包括a)将以下物质引入细胞中(i)至少一种靶向内切核酸酶或编码靶向内切核酸酶的核酸，所述靶向内切核酸酶结合靶位点并能切割编码所述内源蛋白的染色体序列中的切割位点；和(ii)至少一种包含标签序列的供体多核苷酸，所述标签序列被上游序列和下游序列侧接，所述上游序列和所述下游序列与所述染色体序列中切割位点的任一侧享有基本的序列同一性；和(b)将所述细胞保持在这样的条件下，所述条件使得通过所述靶向内切核酸酶在切割位点引入的双链断裂通过同源性定向的过程修复，使得所述供体多核苷酸中的标签序列被符合读框地整合至所述编码所述内源蛋白的染色体序列中，其中产生标记的内源蛋白。在另一个方面，本公开内容提供一种细胞，所述细胞包含至少一个被符合读框地整合至编码内源蛋白的染色体序列中的标签序列，使得所述细胞表达至少一种标记的内源蛋白。而在另一个方面，本公开内容提供监测内源蛋白的定位的试剂盒。所述试剂盒包含一种细胞，所述细胞具有至少一个被符合读框地整合至编码内源蛋白的染色体序列中的标签序列，使得所述细胞表达至少一种标记的内源蛋白。以下更详细地描述本公开内容的其它方面和重复内容。彩图的引用本申请文件包含至少一张以彩色完成的图片。含彩图的本专利申请出版物的拷贝将在请求并支付必要费用时由专利局提供。附图简沭 图I描述了 TUBAlB基因座上标签序列整合的设计。(A)为显示了用于标签序列整合的靶区的染色体序列(SEQ ID NO: 29)、染色体靶区上的ZFN结合位点(带边框的核苷酸)、ZFN切割位点(黄色箭头)和标签序列整合位点(绿色箭头)的示意图。(B)为描述TUBAlB基因组靶区的示意图，其显示了编码区(红色)、非翻译区(蓝色)和ZFN切割位点(黄色箭头)。(C)为整合前TUBAlB基因组区域的DNA片段的示意图。(D)为含符合读框地与TUBAlB编码序列整合的GFP序列的TUBAlB基因组区域的DNA片段的示意图。(E)为所述标签序列成功整合后产生的在N端与GFP标签融合的内源α -微管蛋白的示意图。图2描述了包含被基因组微管蛋白序列侧接的GFP标签的供体质粒的图谱。图3描述了 U20S细胞中TUBAlB基因组区域的DNA序列(SEQ ID Ν0:4)，其证明了GFP2编码序列被整合至微管蛋白编码区。带下划线的文字表示经测序的区域，加粗文字表示GFP2的编码序列，斜 体文字表示限制位点或接头，加粗并大写的文字表示剪接点的Met密码子。图4描述了 U20S细胞中TUBAlB基因组区域的DNA序列(SEQ ID NO: 5)，其证明了 RFP编码序列被整合至微管蛋白编码区。带下划线的文字表示经测序的区域，加粗文字表示RFP的编码序列，斜体文字表示限制位点或接头，加粗并大写的文字表示剪接点的Met密码子。图5出示了使用对TUBAlB基因座内GFP的靶定整合特异的引物对14个细胞克隆的接头PCR (junction PCR)的琼脂糖凝胶电泳分析。图6显示了表达标记有GFP的内源α -微管蛋白同种型IB蛋白的单独分离的细胞克隆的微分干涉相差(DIC)显微术图像和荧光显微术图像的多个实例。(A) U20S细胞中GFP标记的α-微管蛋白同种型IB蛋白，(B) U20S细胞中GFP标记的α-微管蛋白同种型IB蛋白，(C) U20S细胞中GFP标记的α -微管蛋白同种型IB蛋白，(D) Α549细胞中GFP标记的α-微管蛋白同种型IB蛋白，(E) Α549细胞中GFP标记的α-微管蛋白同种型IB蛋白，(F) Κ562细胞中GFP标记的α-微管蛋白同种型IB蛋白，(G) ΗΕΚ293细胞中GFP标记的α -微管蛋白同种型IB蛋白和(H) ΗΕΚ293Τ细胞中GFP标记的α -微管蛋白同种型IB蛋白。图7描述了包含被基因组微管蛋白序列侧接的RFP标签的供体质粒的图谱。图8显示了 MCFlOa细胞系中RFP整合至TUBAlB区的验证。该整合利用微管蛋白引物通过基因组PCR和接头PCR来验证。(A)显示存在1945 bp RFP/微管蛋白融合物带的DNA印迹和(B)显示在几个克隆中RFP标签序列阳性整合至TUBAlB的基因组PCR (T. I.=靶定整合)。Wt MCFlOa细胞和含RFP整合的U2S0细胞系用作对照。图9描述了 MCFlOa细胞中TUBAlB区的确证序列，其证明了 RFP序列的整合(SEQID Ν0:8) ο带下划线的文字表示经测序的区域，加粗文字表示GFP2的编码序列，斜体文字表示限制位点或接头，加粗并大写的文字表示剪接点的Met密码子。附图说明图10描述了 RFP整合至MCFlOa细胞的TUBAlB基因座以及RFP和GFP整合至U20S细胞的相同基因座的PCR验证。野生型条带为452 bp而靶定整合(T. I.)条带为1190 bp。图11显示出在MCFlOa克隆5中RFP的插入位点处的接头(junction)具有预期大小。左边接头的预期大小为453 bp而右边接头的预期大小为4089 bp。图12描述蛋白印迹，其检测含RFP标记的微管蛋白的MCFlOa克隆5中RFP和微管蛋白的表达。图13证明了大于99%的野生型MCFlOa细胞缺少红色荧光，而大于99%包含RFP标记的微管蛋白的MCFlOa克隆5细胞有红色荧光。图14描述了包含RFP标记的微管蛋白的转染的MCFlOa细胞的表型稳定性。(A)在P2的表达和(B)在P18的表达。 DIC图像在左边而荧光图像在右边。图15描述了包含被基因组STAT3序列侧接的GFP标签的供体序列的图谱。图16描述的示意图显示了用于标签序列整合的STAT3区的染色体序列(SEQ IDNO: 27)、染色体靶区上的ZFN结合位点(黄色序列)、ZFN切割位点(黄色箭头)和标签序列整合位点(绿色箭头)。“M”象征氨基酸起始密码子甲硫氨酸。图17描述的Cel-I测定确证了 ZFN在预期位点切割STAT3染色体序列中的效力(第三泳道)。还显示了仅供体多核苷酸对照和含供体多核苷酸对照的ZFN的Cel-I结果。图18出示了编码对STAT3基因座特异的ZFN的合成RNA的琼脂糖凝胶电泳分析。图19描述了转染了用于将GFP整合至STAT3基因座的ZFN和供体多核苷酸的细胞的细胞分选仪数据(A)。还显示了阴性对照细胞的细胞分选仪数据(B)。图20描述了基因组中2个不同的靶区的接头PCR的琼脂糖凝胶电泳分析编码β -肌动蛋白的ACTB区用编码GFP或RFP的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：D马尔科夫，N津泽，D瓦萨，张帆，张红艺，
申请(专利权)人：西格马奥尔德里奇有限责任公司，
类型：
国别省市：