一种测定蝙蝠蛾被毛孢菌丝体粉中虫草素、腺苷、甘露醇的方法技术

本发明专利技术涉及一种测定蝙蝠蛾被毛孢菌丝体粉中虫草素、腺苷、甘露醇的方法，特别是利用高效液相色谱质谱联用仪来同时测定蝙蝠蛾被毛孢菌丝体粉中虫草素、腺苷、甘露醇含量的方法，包括样品和标准品的前处理、高效液相色谱质谱联用仪的条件优化及样品测定、数据的分析等步骤，最终确定流动相为甲酸-甲醇混合物(94:6,v/v)，色谱柱为ThermoBioBasic-18PIONEER(150mm×2.1mm,i.d.5μm)，采用选择性离子检测模式（SIM），对三个活性组分进行定性、定量分析。本方法结合了色谱和质谱的优点，测定过程简单快速，测定结果准确、灵敏度高，适用于蝙蝠蛾被毛孢菌丝体粉中的虫草素、腺苷、甘露醇的分析检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，特别是利用高效液相色谱质谱联 用仪同时测定蝙蝠蛾被毛孢菌丝体粉中虫草素、腺苷、甘露醇含量的方法。
技术介绍
冬虫夏草是一种寄生真菌，学名为蝙蝠蛾被毛孢，寄生于生长在高海拔的对鳞翅目的幼虫，在中国已被作为食品和草药用于治疗各种疾病。它不仅可以作为一种珍贵的药物，用来治疗许多疾病，如咳嗽、肺和肾脏的功能紊乱，据最近的报道，还可作为一种抗衰老的保健滋补食品。冬虫夏草被证明含有虫草素、腺苷、甘露醇、肌苷、腺嘌呤、虫草素多糖等主要生物活性成分，具有抗氧化、增强免疫力和调节人体内分泌系统的功效，特别是其中三个最重要的活性成分虫草素、腺苷、甘露醇，可视为冬虫夏草的质量评价的指标。许多研究报道指出，人工的虫草菌丝也具有相似的化学成分、药理作用和临床疗效，能够替代天然的冬虫夏草，而且一些不法商贩将一些替代品如蛹虫草和添加剂进行销售，使市场鱼龙混杂，使人们的身体健康及生命财产受到了伤害，因此，虫草及其产品的质量控制是非常重要的，急需一些快速、有效的检测方法来确保其安全和功效。目前腺苷成分含量是利用薄层色谱法、高效液相色谱和毛细管电泳来检测的，但灵敏度低、选择性差和耗用时间长。甘露醇的定量方法主要报道如氧化还原法、高效液相色谱、气相色谱、薄层色谱扫描等。黄光裕等曾采用LC/ESI-MS法，以2-氯腺苷为内标物来测量冬虫夏草中腺苷的含量(Huang LF, Liang YZ, Guo FQ, Zhou ZF, Cheng BM.Simultaneous separation and determination of active components in Cordycepssinensis and Cordyceps militarris by LC/ESI-MS. J Pharm Biomed Anal 2003 Dec4;33(5):1155-62.)，但此种方法一次只能测量一种组分，不能同时检测虫草素、腺苷、甘露醇，并且耗时长，灵敏度不高。
技术实现思路
为克服上述方法的不足，本专利技术提供了一种用高效液相色谱质谱联用仪同时测定蝙蝠蛾被毛孢菌丝体粉中虫草素、腺苷、甘露醇含量的方法，与以上方法相比具有分离能力强、定性分析结果准确、检测限低、分析时间快等优点。所采用的技术方案如下 本专利技术提供了一种利用高效液相色谱一质谱联用仪快速、同时测定蝙蝠蛾被毛孢菌丝体粉中虫草素、腺苷、甘露醇的方法，包括以下步骤 (一)样品处理精确称取冬虫夏草样本的菌丝体粉O. 50 g，均匀研磨和混合，在IOml容量瓶瓶中用超纯水定容，水浴超声提取30分钟，然后用O. 45 μ m过滤膜过滤，所得滤液用高效液相色谱一质谱联用仪进行测定； (二)高效液相色谱一质谱联用仪的测定条件 (1)液相条件色谱柱为Thermo BioBasic-18 PIONEER (150 mm X 2. I mm, i. d. 5μπι);柱温为30°C，进样量为5μ I ;流动相为0.05 mol/L甲酸-甲醇混合溶液(94:6，v/V)，流速为 O. 2 ml/min ； (2)质谱条件离子源为电喷雾离子源(ESI)，虫草素、腺苷采用正电离模式，甘露醇采用负电离模式；保护气体为氮气，流速为40 A. U.;辅助气体为氦气,流速为5 A. U.;毛细管温度为350°C，喷雾电压为4. O kV,毛细管电压是28 V ;ESI接口和质谱参数进行优化，以达到最佳；选择性离子检测模式(SIM)进行质谱采集； (三)绘制标准曲线 分别称取标准品腺苷、虫草素、甘露醇适量，用超纯水溶解使腺苷、虫草素浓度为100mg/L,甘露醇浓度为500mg/L，作为贮备液；然后分别适量储备液，用纯水稀释，依次配置腺苷和虫草素浓度均为 10. O mg/L、20.0 mg/L、30. O mg/L、40. O mg/L、50. O mg/L,甘露醇浓度为 100. O mg/L,200. O mg/L、300. O mg/L,400. 0 mg/L、500. 0 mg/L 的混合标准工作液，将混合标准工作液进样IOul在所述色谱和质谱条件下进行测定，以各组分的峰面积对浓度作回归分析，得到峰面积-浓度标准曲线； (四)数据的分析 测得虫草素的线性范围为1-50 μ g/ml，腺苷的线性范围为0-500 yg/ml，甘露糖醇的线性范围为1-50 μ g/ml，三种成分的回收率从95. 2%到103. 9%，腺苷、虫草素、甘露醇的检出限分别为 O. 16 μ g/ml, O. 23 μ g/ ml、7. 3 μ g/ml。本专利技术将色谱对样品的高分离能力，与质谱的高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，具有分离能力强、定性分析结果准确、检测限低、分析时间快等优点。附图说明图I为本专利技术标准品的虫草素、腺苷、甘露醇的质谱图。图2为本专利技术样品的虫草素、腺苷、甘露醇的质谱图。图3为本专利技术标准品中的虫草素、腺苷、甘露醇色谱图。图4为本专利技术样品的虫草素、腺苷、甘露醇色谱图。图5为本专利技术虫草素的标准曲线。图6为本专利技术腺苷的标准曲线。图7为本专利技术甘露醇的标准曲线。具体实施例方式I、实验仪器及材料 (O仪器美国热电公司生产的高效液相色谱-离子阱质谱联用仪，型号为LCQ-Deca-XP,其配备的 LC 系统(Thermo Finnigan, San Jose, CA, U.S.A.),包括四兀泵、在线脱气器、柱加热器部分，自动取样器和PDA(光电二极管阵列)检测器和多级离子讲质谱仪(Thermo Finnigan),其由一个ESI接口和一个离子讲质谱分析仪,数据处理和获取通过 Xcalibur I. 3 工作站；Milli-Q 超纯水系统((Millipore Inc, Billerica , MA，U. S. A.)；电子天平,高速离心机,超声仪； (2)试剂甲醇(HPLC 级，Merck, Darmstadt, Germany);甲酸(分析级，Merck,Darmstadt, Germany);虫草素标准品(纯度≥99%)、腺苷标准品(纯度≥99%)、甘露醇标准品(纯度> 99%)、冬虫夏草菌丝体粉胶囊。2、样品处理 精确称取冬虫夏草样本的菌丝体粉O. 50 g，均 匀研磨和混合，在IOml容量瓶瓶中用超纯水定容，水浴超声提取30分钟，然后用O. 45 μ m过滤膜过滤，所得滤液用高效液相色谱一质谱联用仪进行测定。3、高效液相色谱一质谱联用仪的测定条件 (1)液相条件色谱柱为Thermo BioBasic-18 PIONEER (150 mm X 2· I mm, i. d. 5μπι);柱温为30°C，进样量为5μ I ;流动相为O. 05 mol/L甲酸-甲醇混合溶液(94:6，v/V)，流速为 O. 2 ml/min ； (2)质谱条件离子源为电喷雾离子源(ESI)，虫草素、腺苷采用正电离模式，甘露醇采用负电离模式；保护气体为氮气，流速为40 A. U.;辅助气体为氦气，流速为5 A. U.;毛细管温度为350°C，喷雾电压为4. O kV,毛细管电压是28 V ;ESI接口和质谱参数进行优化，以达到最佳；选择性离子检测模式(SIM本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定蝙蝠蛾被毛孢菌丝体粉中虫草素、腺苷、甘露醇的方法，其特征在于利用高效液相色谱—质谱联用仪同时测定蝙蝠蛾被毛孢菌丝体粉中的虫草素、腺苷、甘露醇。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄宏南，
申请(专利权)人：黄宏南，
类型：发明
国别省市：