本发明专利技术涉及一种检测M?BCR融合基因mRNA的荧光定量PCR诊断试剂盒，属于生物技术领域。包含检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括M?BCR融合基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针。能有效地检测e14a3、e13a3、e14a2和e13a2等M?BCR融合基因形式。M?BCR融合基因是多能造血干细胞恶性克隆的基因标志，是慢性粒细胞白血病典型的分子标志物，其与抑制白血病细胞的凋亡有关。采用敏感性及特异性均较高的荧光定量PCR检测M?BCR融合基因mRNA表达量，其检测结果的特异性和敏感度均显著提高。本发明专利技术试剂盒为临床慢性粒细胞白血病患者制定治疗方案以及预测预后提供了一种全新的快速简便的基因诊断技术。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种检测M BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒。
技术介绍
慢性粒细胞白血病（chronic myelocytic leukemia,CML）患者的血细胞中除了90%出现Ph1染色体阳性以外，还多伴随有t(9；22)(q34；q11)易位，即位于9号染色体长臂上的abl原癌基因易位到22号染色体长臂的断裂点集中区bcr，形成M BCR融合基因。该融合基因负责编码具有增强酪氨酸激酶的活性的P210蛋白，从而改变细胞多种蛋白质酪氨酸磷酸化水平和细胞微丝机动蛋白的功能，导致细胞内信号传导异常，使细胞丧失对周围环境的反应性，延缓凋亡的发生。BCR-ABL融合基因转阴率和Ph+细胞消失率与慢性粒细胞白血病患者的疾病进展密切相关。一旦BCR-ABL融合基因转阴率和Ph+细胞消失率得不到及时改善，慢性粒细胞白血病将有可能从慢性期发展到加速期和急变期。酪氨酸激酶抑制剂是治疗慢性粒细胞白血病的主要药物，但有患者对此类药物存在原发性抵抗或者由于长期给予此药而出现继发性抵抗，发生药物抵抗的主要原因与M BCR融合基因的表达水平有关。M BCR融合基因表达水平高的急变期多表现对此类药物的敏感性降低，同时诱变出对此类药物抵抗的突变克隆的时间缩短。实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）技术实现了PCR从定性到真正意义的定量的飞跃，为人类疾病基因的定量检测提供了一个行之有效的检测工具，与普通PCR相比具有更强的特异性和灵敏度，而且检测快速、降低了污染等优点，但目前尚未有关实时荧光定量PCR方法检测M BCR融合基因。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术实施例提供了一种检测M BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒。本专利技术所提供的检测M BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒，包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括M BCR融合基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中：M BCR融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；M BCR融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；M BCR融合基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:3所示；ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:4所示；ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:5所示；ABL基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示；所述cDNA第一链合成试剂含有MgC12、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)15、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq酶、UNG酶和无RNase去离子水。进一步地，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列、内部阳性控制序列的引物和Taqman荧光探针，其中：内部阳性控制序列如序列表中SEQ ID NO:7所示；内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO:8所示；内部阳性控制序列的下游引物如序列表中SEQ IDNO:9所示；内部阳性控制序列的Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:10所示。进一步地，所述M BCR融合基因Taqman荧光探针和ABL基因Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团TAMRA，所述内部阳性控制序列Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。具体地，所述内参基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示。具体地，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有M BCR融合基因的总RNA样品。具体地，所述cDNA第一链合成试剂为：25mmol/L MgC124μL，10×逆转录酶缓冲液2μL，10mmol/L dNTP 2μL，RNA酶抑制剂0.5μL，Oligo(dT)150.5μg，AMV逆转录酶1.5U和无RNase去离子水，总体积11μL。具体地，所述荧光定量PCR的混合液（以反应体系终浓度表示）为：1×的PCR预混合液（原液为2×PCR Premix）、2.5-4.0mM的Mg2+、0.2-0.4mM的dNTPs、0.3-0.6mM的dUTP、0.2U/μL的Taq酶和0.01-0.05U/μL的UNG酶以及无RNase去离子水。本专利技术试剂盒的优点和效果如下：（1）敏感性高：可重复敏感度为0.01%，即10000个细胞中有一个含M BCR融合基因就可以被检测出。（2）特异性强：使用特异性探针对定量分子进行识别，准确性高，同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好且假阳性低。（3）简便安全：操作简单、安全、自动化程度高而且防止污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易被污染，同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理，无需要担心放射性污染。（4）全程监控：本专利技术实施例提供的试剂盒引入了内部阳性控制质量控制体系，对检测过程进行全程质量监控，有效避免假阳性或者假阴性。（5）快速：速度快并且高通量，检测实验可在3-4小时完成。本专利技术的试剂盒能快速、准确的定量检测M BCR融合基因mRNA水平，有效杜绝了假阳性和假阴性的发生，用于慢性粒细胞白血病的诊断及治疗过程中微小残留病的监测，为慢性粒细胞白血病的诊断、制定治疗方案及疗效评价和预后提供了重要的检测手段。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1A是本专利技术实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增1.0x106-1.0x103拷贝的内部阳性控制序列标准品的荧光曲线图；图1B是由本专利技术实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增1.0x106-1.0x103拷贝的内部阳性控制序列标准品的荧光曲线图得到的标准曲线图；图2A是本专利技术实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增1.0x106-1.0x103拷贝的ABL标准品的荧光曲线图；图2B是由本专利技术实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增1.0x106-1.0x103拷贝的ABL标准品荧光曲线图得到本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测M？BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒，包含检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，其特征在于，所述检测用引物、荧光探针包括M？BCR融合基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中：M？BCR融合基因上游引物序列如序列表中SEQ？ID？NO:1所示；M？BCR融合基因下游引物序列如序列表中SEQ？ID？NO:2所示；M？BCR融合基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ？ID？NO:3所示；ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ？ID？NO:4所示；ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ？ID？NO:5所示；ABL基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ？ID？NO:6所示；所述cDNA第一链合成试剂含有MgC12、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)15、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq酶、UNG酶和无RNase去离子水。
【技术特征摘要】
2012.09.29 CN 201210376427.21.一种检测M BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒，包含检测用引物、荧光探针、
cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，其特征在于，所述
检测用引物、荧光探针包括M BCR融合基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探
针，其中：
M BCR融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；
M BCR融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；
M BCR融合基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:3所示；
ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:4所示；
ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:5所示；
ABL基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示；
所述cDNA第一链合成试剂含有MgC12、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、
Oligo(dT)15、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预
混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq酶、UNG酶和无RNase去离子水。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列、
内部阳性控制序列的引物和Taqman荧光探针，其中：内部阳性控制序列如序列表中SEQ ID
NO:7所示；内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO:8所示；...
【专利技术属性】
技术研发人员：李艳，童永清，
申请(专利权)人：李艳，童永清，
类型：发明
国别省市：
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