一种生产1,3-丙二醇的菌株筛选方法与应用技术

一种生产1,3-丙二醇的菌株筛选方法与应用，涉及1,3-丙二醇。提供丁酸梭菌（Clostridium?butyricum）Gen160以及利用废甘油生产1,3-丙二醇的菌株筛选方法与应用。步骤为取采集样品加入到白菜汁中，富集培养后置水浴，杀死非芽孢菌，转入梭菌增殖液体培养基，厌氧培养再置水浴，转入发酵培养基，厌氧选择性富集培养后进行高效液相色谱分析发酵产物，选取能生产1,3-丙二醇的阳性菌；采用高层琼脂柱法分离出单菌落；进行好氧和厌氧培养，除去兼性厌氧菌，得到严格厌氧菌，分析发酵产物，选取能够生产1,3-丙二醇和培养特征、菌落形态均符合丁酸梭菌培养特征的菌株进行16S?rDNA序列分析鉴定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及1,3-丙二醇，尤其是涉及一种生产1,3-丙二醇的菌株筛选方法与应用。
技术介绍
1,3-丙二醇是一种重要的化工原料，它可直接作为抗冻剂、多种增塑剂、洗涤剂、防腐剂和乳化剂的合成原料，也可用于食品、化妆品和制药等行业。其最主要的用途是作为合成聚酯、聚醚和聚氨酯等高分子材料的单体。目前，1,3-丙二醇的合成方法主要有两种，即化学法和生物法。其中化学法生产1,3-丙二醇已日趋成熟，但化学法消耗了不可再生的有限资源，并造成了环境污染。近年来，生物转化法以其利用可再生资源、对环境友好等特点日益受到人们的重视。随着石化资源的日益枯竭，生物法必将取代化学法。21世纪，石油供需矛盾日益尖锐，石油化工及石化燃料燃烧造成的环境问题日益突出，开发新的对环境无害的可再生能源日益得到各国的重视。生物柴油是一种环境友好的生物燃料，在使用中可部分或全部替代石化柴油。近年来，生物柴油产业异军突起，飞速发展，而废甘油是生物柴油生产过程中的主要副产物，每生产1吨生物柴油会副产0.1吨废甘油。随着世界范围内生物柴油需求量和生产量的迅猛增长，废甘油成为丰富而廉价的原料，对它的有效利用也成为紧迫的课题。目前以甘油为原料制备1,3-丙二醇主要有两种方法：1.中国专利200710113923.8公开了一种采用化学法转化甘油制备1,3-丙二醇的方法，采用两步反应，第一步是1,3-溴氯丙烷与乙酸钠在醇类催化剂的作用下生成1,3-丙二乙酯，第二步是上步反应得到的双脂与甲醇在树脂类催化剂的作用下生成1,3-丙二醇。2.中国专利200710048122.8公开了一种采用微生物发酵甘油制备1,3-丙二醇的方法，该方法所使用的菌种为克雷伯氏杆菌，为条件致病菌，存在生物安全性方面的隐患。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种丁酸梭菌（Clostridium butyricum）Gen160。本专利技术的第二目的在于提供丁酸梭菌（Clostridium butyricum）Gen160的筛选方法。本专利技术的第三目的在于提供丁酸梭菌（Clostridium butyricum）Gen160的改造方法。本专利技术的第四目的在于提供丁酸梭菌（Clostridium butyricum）Gen160在利用废甘油生产1,3-丙二醇中的应用。所述丁酸梭菌（Clostridium butyricum）Gen160，是一种益生菌，该菌种已于2012年07月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.6317，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。所述丁酸梭菌（Clostridium butyricum）Gen160从土壤样品中筛选得到，具体步骤为：取采集样品各1g，加入到9mL白菜汁中，37℃密封富集培养24h后置80℃水浴10min，杀死非芽孢菌，转入梭菌增殖液体培养基，37℃厌氧培养24h再置80℃水浴10min，转入发酵培养基，37℃厌氧选择性富集培养24h后进行高效液相色谱分析发酵产物，选取能够生产1,3-丙二醇的阳性菌；再采用高层琼脂柱法，分离出单菌落；同时进行好氧和厌氧培养，除去兼性厌氧菌，得到严格厌氧菌，分析发酵产物，选取能够生产1,3-丙二醇和培养特征、菌落形态均符合丁酸梭菌培养特征的菌株进行16S rDNA序列分析鉴定。所述梭菌增殖液体培养基即生长培养基（RCM培养基）为：胰蛋白胨，10g/L；牛肉膏，10g/L；酵母粉，3g/L；葡萄糖，5g/L；NaCl，3g/L；NaAc，3g/L；可溶性淀粉，1g/L；半胱氨酸盐酸盐，0.5g/L；pH 7.5。所述高层琼脂柱培养法的具体步骤为：加热融化10管加入Vc的RCM固体培养基（每管9mL培养基），待冷至80℃左右，在第1管中接入1mL菌液，充分振荡均匀后，迅速将其1mL培养基倒入第2管，充分振荡均匀后将其1mL培养基倒入第3管，依次稀释至第10管。将试管放入冰中，迅速冷却。待琼脂凝固，每管加入2.5mL灭菌的液体石蜡，置37℃恒温箱内培养24h。用接种环挑选单菌落于无菌水中，振荡混匀，用无菌注射器分别转入RCM液体培养基血清瓶中，37℃、150rpm摇床培养36h。所述丁酸梭菌（Clostridium butyricum）Gen160的改造方法的具体步骤为：将丁酸梭菌（Clostridium butyricum）Gen160接入含有甘油的种子培养基中培养10～20h，然后以4%～10%的接种量接种于含废甘油浓度50g/L的发酵培养基的血清瓶中进行摇瓶厌氧培养，培养温度为31～39℃，发酵培养基中加入7～15g/L碳酸钙以维持稳定的pH。培养12～24h后，以4%～10%的接种量接种于另一瓶同样培养基成分的血清瓶中，如此循环20次，将菌种保存于生长培养基（RCM培养基）中并于4℃冰箱保存，得到丁酸梭菌第20代菌株，记作Gen20；依次提高废甘油浓度70、80、90、100g/L，分别采用上述步骤进行不断传代培养，每种条件培养20代，分别记为Gen40、60、80、100；在Gen100基础上，依次提高抑制菌体生长的副产物丁酸浓度15、20、25g/L，分别采用上述步骤进行不断传代培养，每种条件培养20代，分别记为Gen120、140、160；分别在分批发酵和补料分批发酵条件下对比保存菌株，择优进行单菌落的分离，利用高层琼脂柱法挑选出纯菌株。所述种子培养基为：甘油，20g/L；K2HPO4·3H2O，4.45g/L；KH2PO4，1.3g/L；(NH4)2SO4，2g/L；MgSO4·7H2O，0.2g/L；CaCl2·2H2O，0.02g/L；酵母粉，1g/L；微量元素溶液，1mL；Fe溶液，1mL；自然pH。所述发酵的温度可为31～39℃。所述发酵的搅拌速度可为100～300rpm。所述发酵体系的pH值可为6.0～8.0。所述发酵的时间可为12～60h。所述发酵的接种量的体积百分比可为4%～10%。所述发酵培养基为：废甘油（甘油含量由液相色谱分析测定）30～120g/L；K2HPO4·3H2O，0.1～2.0g/L；KH2PO4，0.1～2.0g/L；(NH4)2SO4，0.5～5.0g/L；MgSO4·7H2O，0.1～1.0g/L；CaCl2·2H2O，0.01～0.2g/L；酵母粉，0.5～5.0g/L；微量元素溶液，1mL；Fe溶液1mL。所述废甘油为生物柴油生产过程中的副产物。所述Fe溶液为：F本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种菌种，所述菌种为丁酸梭菌（Clostridium？butyricum）Gen160，该菌种已于2012年07月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.6317，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。

【技术特征摘要】
1.一种菌种，所述菌种为丁酸梭菌（Clostridium butyricum）Gen160，该菌种已于2012
年07月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC
No.6317，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码
100101。
2.如权利要求1所述的丁酸梭菌（Clostridium butyricum）Gen160的筛选方法，其特
征在于其具体步骤为：
取采集样品各1g，加入到9mL白菜汁中，37℃密封富集培养24h后置80℃水浴10
min，杀死非芽孢菌，转入梭菌增殖液体培养基，37℃厌氧培养24h再置80℃水浴10min，
转入发酵培养基，37℃厌氧选择性富集培养24h后进行高效液相色谱分析发酵产物，选取
能够生产1,3-丙二醇的阳性菌；再采用高层琼脂柱法，分离出单菌落；同时进行好氧和厌
氧培养，除去兼性厌氧菌，得到严格厌氧菌，分析发酵产物，选取能够生产1,3-丙二醇和
培养特征、菌落形态均符合丁酸梭菌培养特征的菌株进行16S rDNA序列分析鉴定。
3.如权利要求2所述的丁酸梭菌（Ciostridium butyricum）Gen160的筛选方法，其特征
在于所述梭菌增殖液体培养基为：胰蛋白胨，10g/L；牛肉膏，10g/L；酵母粉，3g/L；葡
萄糖，5g/L；NaCl，3g/L；NaAc，3g/L；可溶性淀粉，1g/L；半胱氨酸盐酸盐，0.5g/L；
pH 7.5。
4.如权利要求2所述的丁酸梭菌（Clostridium butyricum）Gen160的筛选方法，其特征
在于所述高层琼脂柱培养法的具体步骤为：加热融化10管加入Vc的RCM固体培养基，每管9mL
培养基，待冷至80℃，在第1管中接入1mL菌液，充分振荡均匀后，迅速将其1mL培养基倒入
第2管，充分振荡均匀后将其1mL培养基倒入第3管，依次稀释至第10管，将试管放入冰中，
迅速冷却，待琼脂凝固，每管加入2.5mL灭菌的液体石蜡，置37℃恒温箱内培养24h，用接
种环挑选单菌落于无菌水中，振荡混匀，用无菌注射器分别转入RCM液体培养基血清瓶中，
37℃、150rpm摇床培养36h。
5.如权利要求1所述的丁酸梭菌（Clostridium butyricum）Gen160的改造方法，其特征
在于其具体步骤为：
将丁酸梭菌（Clostridium butyricum）Gen160接入含有甘油的种子培养基中培养10～20
h，然后以4%～10%的接种量接种于含废甘油浓度50g/L的发酵培养基的血清瓶中进行摇瓶厌
氧培养，培养温度为31～39℃，发酵培养基中加入7～15g/L碳酸钙以维持稳定的pH，培养

\t12～24h后，以4%～10%的接种量接种于另一瓶同样培养基成分的血清瓶中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：方柏山，陈斌，朱春杰，王世珍，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：