一种葡萄糖氧化酶分泌增强型菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种过量表达Haclp基因增强分泌表达葡萄糖氧化酶的方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术采用基因重组技术将毕赤酵母的Haclp基因克隆连接到毕赤酵母表达载体pPICZα，并转化入Pichia?pastoris?GS115-pPIC9K-GOX保藏编号为CCTCC?NO：M2012266的菌株中，经筛选鉴定得到一株较原有菌株增强分泌表达葡萄糖氧化酶的菌株。该菌株表达的葡萄糖氧化酶在摇瓶中的酶活为66.24U/mL，比使用该方法前的酶活55.31U/mL有明显提高，此外本方法能显著提高生产效率，这为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种葡萄糖氧化酶生产菌株，特别是一种葡萄糖氧化酶分泌增强型菌株及其应用，属于基因工程

技术介绍
葡萄糖氧化酶是生物领域中最主要的工具酶之一。自1967年Updike和Hicks将GOD固定在Clark氧电极表面，将其应用于血糖测定以来，GOD被广泛应用于食品、饲料、医药等许多相关领域。在食品工业中，由于氧的存在，引起许多不利于产品质量的化学反应，并为许多微生物生长创造了条件。目前，许多国家已将GOD作为工人的安全抗氧剂而广泛应用于各种食品和食品加工工艺中。虽然用途多样，GOD的作用主要在于除葡萄糖、除氧、形成过氧化氢、形成葡萄糖酸四个方面。利用其专一氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析仪，能快速准确简易地测定各种食品中的葡萄糖含量，指导生产。在医药工业中，GOD作为试剂盒、酶电极等用于血清(浆)、尿液及脑脊液中葡萄糖的体外定量分析;GOD制成的酶制剂还可用于除去或缓解牙斑、牙垢和龋齿的形成防止口腔疾病和牙病的发生。此外，由于可以催化生成H202，还可用于对H2O2敏感的淋巴瘤的导向目标的治疗。GOD还是一种新型的酶饲料添加剂，能够改善动物肠道环境，调节饲粮消化，促进动物生长。含葡萄糖氧化酶、乳酸过氧化物和乳铁蛋白的混合饲料添加剂，可用于预防牲畜胃肠道感染、腹泻，并有促进动物生长作用。从动植物组织中提取GOD有一定的局限，酶量亦不丰富；细菌GOD产酶量少；一般采用黑曲霉（具有GRAS资格）和青霉属菌株作为GOD生产菌。我国及美国均采用点青霉及产黄青霉生产GOD，日本常用尼崎青霉，俄罗斯用生机青霉，近年报道胶霉属（Clioctadium）、拟青霉属（Paecilomyces）和帚霉属（Scopulariopsis）也能生产GOD。产量低、酶活低、检测方法复杂是GOD产业化的限制性因素，国内外为此做了大量工作并取得了明显进展。目前国外生产的GOD厂家主要是德国的Boehringer和日本的TOYOBO。规模化生产高活性的GOD还有困难。发酵生产GOD的同时产生大量杂蛋白，分离提取复杂，成本高。本研究在前期研究中构建了基因工程菌Pichia pastoris GS115-pPIC9K-GOX（保藏编号为CCTCC NO：M 2012266），其葡萄糖氧化酶产量获得了一定提高，但如何进一步提高其葡萄糖氧化酶产量以适应工业化的需要是本专利技术要解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种葡萄糖氧化酶分泌增强型菌株，为共表达葡萄糖氧化酶基因和Haclp基因的毕赤酵母基因工程菌。通过将毕赤酵母Haclp基因连接到毕赤酵母表达载体pPICZα，并转化入Pichia pastorisGS115-pPIC9K-GOX（保藏编号为CCTCC NO：M 2012266）的菌株中。所述Haclp基因核苷酸序列如基因核苷酸序列如Genbank XM_002489994.1所示。本专利技术还提供了一种构建上述菌株的方法，步骤如下：1）通过PCR扩增方法或化学全合成获得Haclp基因；2）将Haclp基因连接到毕赤酵母表达载体pPICZα，得到重组质粒pPICZ-Hac1；3）重组载体转化Pichia pastoris GS115-pPIC9K-GOD得到分泌增强型基因工程菌。葡萄糖氧化酶酶活测定方法：GOD活性测定一般采用邻-联(二)茴香胺分光光度法。在有氧条件下，GOD催化葡萄糖脱氢产生H2O2，在过氧化物酶（POD）作用下，氧供体邻-联(二)茴香胺（DH2）被氧化成棕色产物。测540nm处吸光度的变化，根据标准曲线的结果，计算葡萄糖氧化酶活力单位。使用本专利技术提供的菌株摇瓶上酶活为66.24U/mL，比使用该方法前的酶活55.31U/mL有明显提高。这为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。附图说明图1：克隆表达质粒图谱。图2：菌株发酵产葡萄糖氧化酶的能力。具体实施方式实施例1重组菌的构建及鉴定通过化学全合成方法获得Haclp，将其克隆到中间载体pPICZα获得重组质粒pPICZ-Hac1，将重组载体转化Pichia pastoris GS115-pPIC9K-GOX，经筛选鉴定获得重组菌Pichia pastoris GS115-pPIC9K-GOX/pPICZ-Hac1。毕赤酵母GS115-pPIC9K-GOX（Pichiapastoris GS115-pPIC9K-GOX）已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2012266。毕赤酵母的转化采用电转化法。菌株于500mL YPD中培养至OD600=1.2-1.5，1500g离心收集细胞;依次用400mL冰冷的无菌水洗两次细胞，再用40mL冰冷的1mol/L山梨醇洗一次细胞，重悬细胞于1mL 1mol/L山梨醇。100μL原生质体与5-10μg线性化质粒DNA(SacI切)混合，转入冰冷的电转杯，放置5分钟;电击细胞与DNA的混合物(1.5kv，4.2-4.9ms);加入1mL冰冷的1mol/L山梨醇，继续放置30min;再加入0.5mL SOS，30°C放置2小时，偶尔摇动志菌体不易沉淀;用1mol/L山梨醇稀释菌体后涂布于含有博莱霉素（200μg/mL）的固体MD培养基。30°C培养4-6天后挑取单克隆。质粒图谱见图1。实施例2分泌增强型菌株的酶活测定和蛋白电泳培养基：种子和斜面培养基为YPD培养基（1L）：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g；斜面培养基添加琼脂20g；基本发酵培养基为BMGY培养基（1L）：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB 13.4g，100mM磷酸缓冲液（pH 6.0）；诱导培养基为BMMY培养基（1L）：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL，YNB 13.4g，100mM磷酸缓冲液（pH 6.0）；培养方法：将30℃、200rpm下培养到OD600在1.6～1.7之间的种子以2%的接种量转入基本发酵培养基，于30℃、200rpm条件下培养；诱导条件：在BMGY中培养至OD值为1.2-1.5时，将酵母细胞转入BMMY培养基中诱导蛋白的产生。分泌增强型重组菌在摇瓶中酶活为66.24U/mL（74h），比使用该方法前的酶活55.31U/mL（74h）有明显提高（图2）。此外，本专利技术旨在提高酶的产量，然而通过方案我们却发现，使用本方法不但能提高酶的产量，还可可明显提高生产效率，在发酵61h，其酶活力可达到55.31U/mL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡萄糖氧化酶分泌增强型菌株，为共表达葡萄糖氧化酶基因和Haclp基因的毕赤酵母基因工程菌。

【技术特征摘要】
1.一种葡萄糖氧化酶分泌增强型菌株，为共表达葡萄糖氧化酶基因和Haclp基因的
毕赤酵母基因工程菌。
2.权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述Haclp基因连接到毕赤酵母表达载体
pPICZα，所述葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母Pichiapastoris GS115-pPIC9K-GOX中表达。
3.权利要求1所述菌株的构建方法，包括如下步骤：
1）通过PCR方法获得Haclp基因；
2）将步骤1）获得的Haclp基因连接到毕赤酵母表达载体pPICZα，得到重组质粒
pPICZ-Hac1；
3）将步骤2）获得的重组质粒转化Pichia pastoris GS115-pPIC9K-GOX得到分泌增强
型基因工程菌。
4.权利要求3所述的构建方法，其特征在于Haclp基因核苷酸序列如...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈坚，顾磊，张娟，堵国成，沈伊娜，闻一凡，李梦洁，李婷，丁雪，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：