本发明专利技术涉及基因工程技术领域中的基因克隆、重组载体构建、重组质粒表达及纯化等技术，特别是重组鸡γ干扰素及其改良片段的重组载体构建及其生产方法。主要包括利用RT-PCR技术获得包含鸡γ干扰素或期改良片段的完整开放阅读框的目的基因，并构建了含有该目的基因的表达载体，同时建立了目的蛋白诱导表达和分离纯化的工艺。本发明专利技术使得鸡γ干扰素在大肠杆菌中高效表达，为鸡γ干扰素的生产提供快捷、高效、安全、低成本的生产方式，适用于大规模的生产。按本发明专利技术生产地重组鸡γ干扰素可广泛应用于禽类的免疫增强及疫病的防治。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程
中的基因克隆、重组载体构建、重组质粒表达及纯化等技术，特别是重组鸡Y干扰素的重组载体构建及其生产方法。
技术介绍
近年来，人们对动物的病毒性疫病主要采用针对性的疫苗接种的方法进行预防，但随着病毒的变异和传统剂量疫苗的接种，造成动物温和型病毒性 疫病的发生率愈来愈高。近来爆发的禽流感、传染性支气管炎、传染性法氏囊炎、非典型性新城疫等病毒病给禽类养殖带来巨大的经济损失，已成为危害禽类养殖业最为严重的一类疾病，这也给防治病毒性动物疫病也带来了新的挑战。干扰素(Interfeixm)是一类由病毒诱导机体产生的具有干扰病毒在感染和非感染组织中复制的一类小分子蛋白。干扰素分为I型和II型两大类，其中I型干扰素(IFNci和IFN0 )的主要作用为干扰病毒在体内复制，保护非感染组织免受病毒侵扰能力。II型干扰素(IFNy)不仅能够抑制病毒的复制，而且具有很强的免疫调节能力，能够活化B细胞，增强抗体的免疫保护力；刺激T细胞生产相关的细胞因子，调节机体的免疫进程；诱导巨噬细胞的吞噬能力和趋化能力。其对机体的保护和对病毒的防治效果均优于I型干扰素。
技术实现思路
本专利技术的目的在于利用基因重组技术实现鸡Y干扰素的体外表达，并通过改良目的基因片段，生产工艺等，以适应鸡Y干扰素的大规模生产，并显著提高产品性能。本专利技术所提供的重组鸡Y干扰素目的基因是通过以下步骤获得的收集经ConA诱导培养的鸡全血淋巴细胞,按Trizol Reagent说明书的操作方法进行总 RNA 的提取。利用 Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen)试剂盒对提取的总RNA进行反转录合成cDNA。鸡Y干扰素，cDNA序列为I CTAAATCTTGTTCAACTTCAAGATGATATAGACAAACTGAAAGCTGACTTTAACTCAAGTI LNLVQLQDDIDKLKADFNSS61 CATTCAGATGTAGCTGACGGTGGACCTATTATTGTAGAGAAACTGAAGAACTGGACAGAG21HSDVADGGPI IVEKLKNffTE121 AGAAATGAGAAAAGGATCATACTGAGCCAGATTGTTTCGATGTACTTGGAAATGCTTGAA41RNEKRIILSQIVSMYLEMLE181 AACACTGACAAGTCAAAGCCGCACATCAAACACATATCTGAGGAGCTCTATACTCTGAAA61NTDKSKPHIKHISEELYTLK241 AACAACCTTCCTGATGGCGTGAAGAAGGTGAAAGATATCATGGACCTGGCCAAGCCCCCG81NNLPDGVKKVKDIMDLAKPP301 ATGAACGACTTGAGAATCCAGCGCAAAGCCGCGAATGAACTCTTCAGCATCTTACAGAAG101MNDLRIQRKAANELFSILQK36I CTGGTGGATCCTCCGAGTTTCAAAAGGAAAAGGAGCCAGTCTCAGAGGAGATGCAATTGC121LVDPPSFKRKRSQSQRRCNC以上序列为鸡Y干扰素的核苷酸序列和氨基酸序列，其中第1、3、5、7、9、11、13行为核苷酸序列，第2、4、6、8、10、12、14行为氨基酸序列。根据鸡IFN-Y基因序列,应用Primer Premier5. O软件设计引物,使目的片段起始于鸡IFN- Y cDNA基因的起始密码子ATG前6个碱基，终止于鸡IFN- Y基因的终止密码子TAA，包含鸡IFN-Y基因的一个完整开放阅读框。本专利技术所提供的重组鸡Y干扰素的生产方法是将纯化后的目的片段与PMD18-T载体16°C连接30min，然后转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，以获得克隆载体。 本专利技术对阳性克隆载体的筛选是通过PCR及EcoR I和Sal I酶切鉴定实现的。具体操作为取少量重组质粒DNA进行PCR鉴定，并用EcoR I和Sal I进行酶切鉴定(单酶切条带3193bp,双酶切条带541bp, 2652bp)。阳性的重组质粒送由上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。用分析软件DNAStar将测定结果与已知序列进行比对分析，并将阳性质粒命名为pMD18_IFN_ Y。本专利技术阳性表达载体的构建是通过以下步骤实现的用EcoR I和Sal I双酶切阳性重组质粒pMD18_IFN_ Y，将目的基因切下，凝胶回收备用。同样将原核表达载体pET-32a(+)用EcoR I和Sal I双酶切，将酶切后的pET-32a(+)凝胶回收备用。将回收的IFN-Y片段与酶切后回收的pET_32a(+)质粒使用T4连接酶进行连接，16°C连接过夜。并将构建好的载体转化至E. coli BL21感受态细胞，涂布于LB固体培养基(含30 μ g/mL卡那霉素)，37°C培养过夜。常规方法提取重组质粒，进行酶切鉴定和PCR鉴定(单酶切条带6428bp，双酶切条带541bp，5887bp)，阳性重组质粒命名为pET32a-IFN- Y，即工程菌株。本专利技术所述表达为诱导表达，即使用IPTG，42°C诱导6h。本申请同时对上述鸡Y干扰素进行部分序列突变以得到改良的鸡Y干扰素片段，具体的将原氨基酸序列的第105-107位氨基酸由RIQ突变为DNL，经过改良的鸡、干扰素序列如下所示 I CTAAATCTTGTTCAACTTCAAGATGATATAGACAAACTGAAAGCTGACTTTAACTCAAGTI LNLVQLQDDIDKLKADFNSS6I CATTCAGATGTAGCTGACGGTGGACCTATTATTGTAGAGAAACTGAAGAACTGGACAGAG21HSDVADGGPI IVEKLKNffTEI2I AGAAATGAGAAAAGGATCATACTGAGCCAGATTGTTTCGATGTACTTGGAAATGCTTGAA41RNEKRIILSQIVSMYLEMLE181 AACACTGACAAGTCAAAGCCGCACATCAAACACATATCTGAGGAGCTCTATACTCTGAAA61NTDKSKPHIKHISEELYTLK24I AACAACCTTCCTGATGGCGTGAAGAAGGTGAAAGATATCATGGACCTGGCCAAGCCCCCG81NNLPDGVKKVKDIMDLAKPP 301 ATGAACGACTTGGACAACCTGCGCAAAGCCGCGAATGAACTCTTCAGCATCTTACAGAAG 101MNDLDNLRKAANELFSILQK36I CTGGTGGATCCTCCGAGTTTCAAAAGGAAAAGGAGCCAGTCTCAGAGGAGATGCAATTGC121LVDPPSFKRKRSQSQRRCNC以上序列为鸡Y干扰素的核苷酸序列和氨基酸序列，其中第1、3、5、7、9、11、13行为核苷酸序列，第2、4、6、8、10、12、14行为氨基酸序列。并通过合成上述序列按照上述类似方法构建表达所述改良的鸡Y干扰素的工程菌。 具体实施例方式实施例I 一种重组鸡Y干扰素的重组载体构建及本文档来自技高网...
【技术保护点】
重组鸡γ干扰素，其特征在于其氨基酸序列如SEQ？ID？NO：3或5所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵风立，尹建华，吕振华，侯娟娟，
申请(专利权)人：黑龙江省汇丰动物保健品有限公司，青岛科亚华动物药业有限公司，黑龙江省百洲生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。