本发明专利技术提供一种截短型溶血链球菌溶菌素O基因与ASO检测试剂盒。本发明专利技术人克隆部分SLO基因片段，将该部分的SLO基因克隆到大肠杆菌等表达载体中，使之产量表达并利于纯化。具体而言，本发明专利技术人提供一种DNA序列，其碱基序列如SEQ?ID?NO：1所示。根据本发明专利技术，截短的SLO序列能使SLO蛋白的产量大大提高，每升细菌培养物能纯化得到150mg以上的SLO蛋白，纯度90％以上，经过免疫学实验证明，这一分段表达的SLO依然保持了特异的免疫原性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种重组蛋白基因以及试剂盒。更具体而言，涉及一种截短型溶血链球菌溶菌素O重组蛋白与ASO检测试剂盒。
技术介绍
溶血链球菌溶血素O (Sti^ptolysin 0，SL0)是多种溶血性链球菌都会表达的一种分泌型蛋白，人在感染溶血性链球菌后会对SLO产生特异抗体。抗链球菌溶血素O (ASO)的检测，是临床诊断溶血性链球菌感染的重要指标之一。提纯的SLO主要来源于溶血链球菌中SLO的提纯，以及在大肠杆菌表达菌株中表达SLO蛋白并纯化。以上两种方法均存在一些局限性，从溶血链球菌中提纯SL0，得率低，难以大规模生产，同时存在生物安全隐 患；利用原核表达系统表达纯化SL0，由于SLO蛋白对细菌细胞具有毒性，一般难以大量表达。在现有技术中已有人报道了，每升细菌培养物(7-8g菌体湿重/升)能纯化出38. Smg左右蛋白，而其中目的蛋白的纯度只有40% (参见非专利文献I :Sandra Camprub' I,Marc Bruguera, Francesca Canalias. International Journal of BiologicalMacromolecules,38(2006)134-139)。 175-574全长SLO基因是含有571个氨基酸残基(aa)的蛋白，通过结构预测发现，这一蛋白大致可以分为前后三个区域。其中，第一段区域1-77个aa，是胞外分泌信号肽，具有细胞毒性；最后一段459-571aa具有细胞膜铆定功能，是SLO的毒性相关结构域(参见非专利文献 2 Silvia Weis, Michael Palmer. Biochimica et Biophysica Acta,1510(2001)292-299)。我们选择对101_400aa的片段进行克隆表达。现有技术中报道的表达方案，一般只去除蛋白的信号肽部分，表达剩余大部分蛋白，但因为剩余部分的毒性影响细胞生长，产量也不高。由非专利文献I的记载可知，每升细菌培养物(7_8g湿菌体/升)能纯化出38. Smg左右蛋白，而其中目的蛋白的纯度只有40%。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题本专利技术的目的在于提供一种能在表达载体中大量表达SLO的基因以及基因工程菌，并利用该SLO制备ASO检测试剂盒。解决问题的手段本专利技术人将SLO的Domain I和4截去，将剩余的截短的SLO基因克隆到大肠杆菌等表达载体中，使之大量表达并利于纯化。具体而言，本专利技术人提供如下的技术方案。I. 一种DNA序列，其喊基序列如SEQ ID NO I所不。2. 一种DNA序列，其为编码如下蛋白质的序列(a)氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸序列且具有溶血链球菌溶血素O免疫原性的蛋白质。3. —种溶血链球菌溶血素0，其特征在于，(a)氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸序列且具有溶血链球菌溶血素O免疫原性的蛋白质。4. 一种表达载体,其含有权利要求I或2所述的DNA序列。5. 一种制备溶血链球菌溶血素O的方法，包括用技术方案4所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，获得重组的制备溶血链球菌溶血素O。6.根据技术方案5所述的方法，其特征在于，宿主细胞是大肠杆菌。 7. 一种抗溶血链球菌溶血素O检测试剂盒，其特征在于，包含缓冲液、叠氮钠以及包被技术方案3所述的溶血链球菌溶血素O的胶乳。8. 一种抗溶血链球菌溶血素O检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包含如下工序a)将胶乳微球用缓冲液稀释，将缓冲液溶解的技术方案3所述的溶血链球菌溶血素O加入到所述胶乳微球的稀释液中，室温搅拌后，收集沉淀山)用缓冲液重悬所述沉淀，调整所述胶乳浓度至规定浓度。技术效果根据本专利技术，截短的SLO序列能使SLO蛋白的产量大大提高，每升细菌培养物能纯化得到150mg以上的SLO蛋白，纯度90%以上。将SLO重组抗原用来研制ASO胶乳增强试剂盒，发现研制的ASO试剂盒检测临床标本结果和对照ASO试剂盒测试结果相关性很好，证明表达的SLO依然保持了特异的免疫原性。附图说明图I是ASO试剂定标曲线，曲线中的每一个点代表一个含量的校准品，X轴表示ASO含量，Y轴表示吸光度；图2是自制试剂和对照试剂测定50人份血清相关性分析相关性图表；图3是表不SLO基因的克隆的电泳图；图4是经IPTG的诱导过的截短型SLO蛋白电泳图，(+)表示经IPTG的诱导，(_)表示未经IPTG的诱导；图5是上清液和沉淀中的截短型SLO蛋白电泳图。具体实施例方式本专利技术的截短型溶血链球菌溶菌素O基因本专利技术提供一种碱基序列如SEQ ID NO 1所示的DNA序列，以及编码如SEQ IDNO :2所示的氨基酸序列的DNA序列。根据简并密码子原理，简并密码子之间的突变并不改变氨基酸序列，这种突变不会影响蛋白质本身的性质，因此，这一类的变异也属于本申请的专利保护范围之内。此外，与本专利技术提供的DNA序列对应的RNA序列也可实现本专利技术的效果O作为本专利技术的对象的基因序列，并不限于前述SEQ ID NO :1所示的DNA序列以及其中的简并密码子突变序列，还包括编码与该蛋白质具有同等功能的蛋白质的其他基因序列。作为具有同等功能的蛋白质，例如可以为在SEQ ID NO :2限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸序列且具有SLO免疫原性的蛋白质。本专利技术的基因序列可以通过PCR方式从链球菌(Streptococcus pyogenes)的基因组DNA中扩增，或可通过基因合成获得，国内可以进行基因合成的公司有上海生工，上海旭冠，北京英骏等。本专利技术的蛋白质本专利技术还提供一种溶血链球菌溶血素0，其特征在于，(a)氨基酸序列如SEQ IDN0:2所示；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸序列且具有SLO免疫原性的蛋白质。此类蛋白质可以为由SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添 加上述数量的氨基酸残基后的氨基酸序列组成，且具有SLO免疫原性的蛋白质。此外，此类蛋白质还可以为具有与SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列有约70%以上、更优选为80%以上、进一步优选为90%以上、最优选为95%以上的同一性的氨基酸序列且具有SLO免疫原性的蛋白质。此类蛋白质可通过使用《MolecularCloning 3》、《Current Protocols inMolecular Biology))等记载的定点诱变法获得。本专利技术中，在蛋白质的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸序列，是指在同一序列中的任意I个或多个氨基酸序列的位置上的I个或多个氨基酸残基取代、缺失或添加，并且可同时发生取代、缺失或添加中的两种以上。下面例举可互相取代的氨基酸残基，同一组中包含的氨基酸残基可互相取代。A组亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸组天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；(组天冬酰胺、谷氨酰胺山组赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4- 二氨基本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种溶血链球菌溶血素O，其特征在于，(a)所述溶血链球菌溶血素O的氨基酸序列如SEQ？ID？NO：2所示；或者(b)所述溶血链球菌溶血素O的氨基酸序列在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，并且所述溶血链球菌溶血素O具有溶血链球菌溶血素O免疫原性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：北京利德曼生化股份有限公司研发中心，
类型：发明
国别省市：
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