本发明专利技术公开了一种重组乙型脑炎病毒及其应用。本发明专利技术提供了一种蛋白质，是将序列表的序列3所示蛋白质自N末端第218位氨基酸残基由极性氨基酸突变为非极性氨基酸后得到的蛋白质。本发明专利技术还保护编码所述蛋白质的基因、含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、重组病毒或重组菌。本发明专利技术还保护一种乙型脑炎疫苗，它的活性成分为所述重组病毒。本发明专利技术所提供的重组乙型脑炎病毒可作为乙型脑炎疫苗，对于预防乙型脑炎病毒感染具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种重组乙型脑炎病毒及其应用，特别涉及甲基转移酶缺陷型乙型脑炎病毒及其应用。
技术介绍
乙型 脑炎病毒，又称日本脑炎病毒，属于黄病毒科黄病毒属成员，主要由库蚊叮咬传播，临床上可以引起严重的脑炎和神经系统疾病。乙型脑炎主要流行于东南亚地区，致死率高达30%，且约30-50%的患者留下严重的后遗症。据世界卫生组织估计，亚洲地区每年乙型脑炎患者超过16000例，死亡人数超过5000，对人类健康和公共卫生构成严重威胁。而且，近些年来乙型脑炎已蔓延到其他的地区，如巴基斯坦，澳大利亚等国家。它的高致死性及区域扩散性严重危及人类健康，已引起国际社会的广泛关注。目前，对流行性乙型脑炎无有效治疗方法，只能通过疫苗接种进行预防。世界范围内主要有三种乙型脑炎疫苗用于临床，包括原代地鼠肾细胞灭活疫苗，Vero细胞灭活疫苗及原代地鼠肾细胞减毒活疫苗(SA14-14-2)，其中VeiO细胞灭活疫苗主要在美国、欧洲等发达国家使用，后两种疫苗主要应用于印度、中国等发展中国家。乙型脑炎病毒的基因组为长10，976nt的单股正链RNA，包括5'和3'的非编码区及单一开放读码框。该读码框编码3种结构蛋白衣壳蛋白(C)、膜蛋白前体/膜蛋白(PrM/M)和包膜糖蛋白(E)及7种非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。病毒基因组的5'末端有帽子结构，但3'末端无polyA尾巴。非结构蛋白NS5是其基因组编码的最大的蛋白质，在病毒基因组复制和调控宿主抗病毒反应过程中发挥关键作用。NS5蛋白是一种多功能蛋白，具有RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNApolymerase, RdRp)和甲基转移酶(methyltransferase, MTase)活性。其中竣基端约 600个氨基酸残基为RdRp活性区，主要负责病毒基因组RNA的复制。NS5蛋白的甲基转移酶(methyltransferase, MTase)活性区主要位于氨基端，与病毒基因组5’端I型帽子结构(m7GpppAm-pGp)的形成密切相关。在帽子结构形成过程中(即GpppA-RNA — m7GpppA_RNA — m7GpppAm-RNA),MTase参与了两步甲基化反应，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine,SAM)为甲基供体，将腺苷酸核糖的2’ -O和N-7甲基化，形成产物S-腺苷-I-高胱氨酸(S-adenosyl-l-homocysteine, SAH)。NS5的MTase活性对于病毒的复制与感染至关重要，当N-7甲基化活性缺陷时、病毒感染复制能力完全丧失，而当2’ -O甲基化活性缺陷后、病毒仍具有复制能力、但其致病性显著减低。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种重组乙型脑炎病毒及其应用。本专利技术提供了一种蛋白质，是将序列表的序列3所示蛋白质自N末端第218位氨基酸残基由极性氨基酸突变为非极性氨基酸后得到的蛋白质。该突变使所述蛋白质2’ -O位的甲基化活性丧失，影响乙型脑炎病毒转录加帽过程。编码所述蛋白质的基因也属于本专利技术的保护范围。所述基因具体可为如下I) -3)中任一所述的DNA分子1)序列表的序列2自5’末端第7677-10391位核苷酸所示的DNA分子；2)在严格条件下与I)所述的DNA分子杂交且编码所述蛋白质A的DNA分子；3)与I)或2)所述的DNA分子具有90%以上的同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。上述严格条件可为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下杂交，然后用2XSSC、0. 1%SDS和I X SSC,O. 1%SDS各洗膜一次。所述极性氨基酸具体可为谷氨酸(E)。所述非极性氨基酸具体可为丙氨酸(A)。 含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、重组病毒或重组菌均属于本专利技术的保护范围。所述重组表达载体可为在表达载体的多克隆位点插入序列表的序列2所示的双链DNA分子得到的重组质粒。所述重组表达载体具体可为在表达载体的pANCR-Ll载体的多克隆位点(如Asc I和XhoI酶切位点之间)插入序列表的序列2所示的双链DNA分子得到的重组质粒pAJE70-E218A。所述pANCR-Ll载体为序列表的序列4所示的质粒。所述重组病毒具体可为基因组DNA如序列表的序列2所示的重组乙型脑炎病毒。所述重组病毒具体可为将以上任一所述的重组表达载体导入离体哺乳动物细胞并培养哺乳动物细胞得到的重组病毒。所述哺乳动物细胞具体可为BHK-21细胞、Vero细胞或C6/36细胞。所述重组病毒具体可为将乙型脑炎病毒中编码NS5蛋白第218位氨基酸残基的核苷酸由极性氨基酸的编码序列突变为非极性氨基酸的编码序列得到的重组病毒。所述NS5蛋白如序列表的序列3所示。所述极性氨基酸具体可为谷氨酸(E)。所述非极性氨基酸具体可为丙氨酸(A)。所述谷氨酸的编码序列具体可为“gag”，所述丙氨酸的编码序列具体可为 “gcc，，。本专利技术还保护以上任一所述重组病毒在制备乙型脑炎疫苗中的应用。所述疫苗具体可为预防乙型脑炎病毒感染的疫苗。本专利技术还保护一种乙型脑炎疫苗，它的活性成分为以上任一所述重组病毒。所述疫苗具体可为预防乙型脑炎病毒感染的疫苗。本专利技术还保护一种降低乙型脑炎病毒的甲基转移酶活性的方法，是将乙型脑炎病毒中编码NS5蛋白第218位氨基酸残基的核苷酸由极性氨基酸的编码序列突变为非极性氨基酸的编码序列。所述NS5蛋白如序列表的序列3所示。所述极性氨基酸具体可为谷氨酸(E)0所述非极性氨基酸具体可为丙氨酸(A)。所述谷氨酸的编码序列具体可为“gag”，所述丙氨酸的编码序列具体可为“gcc”。本专利技术提供的重组乙型脑炎病毒(乙型脑炎病毒E218A)为甲基转移酶缺陷型，具有如下优点(I)充分减毒，安全性很高；(2)减毒特征稳定，遗传稳定性好，回复为野生型病毒的可能性极低；(3)只在细胞质中复制(即RNA病毒基因组的复制、病毒的组装、成熟释放等过程均在细胞质中进行)，其携带的病毒基因组无整合到宿主细胞基因组中的危险；(4)能诱导产生针对野生型乙型脑炎病毒的免疫应答；(5)能够在动物模型中保护动物免受致死剂量的外源乙型脑炎病毒的攻击。综上所述，本专利技术所提供的重组乙型脑炎病毒可作为乙型脑炎疫苗，对于预防乙型脑炎病毒感染具有良好的应用前景。附图说明图I为野生型乙型脑炎病毒全长RNA的cDNA的结构示意图以及突变位点示意图。图2为实施例I的步骤三的结果。图3为实施例2中间接免疫荧光的结果。图4为实施例3中空斑试验的结果。图5为实施例4中乙型脑炎病毒的在不同细胞内的增殖特征的结果。图6为实施例5中各代病毒液空斑试验的结果。 图7为实施例7中乙型脑炎病毒的神经侵袭力特征的结果(存活率)。图8为实施例7中乙型脑炎病毒的神经侵袭力特征的结果(病毒滴度)。图9为实施例8中乙型脑炎病毒E218A对干扰素的敏感性测定步骤I的结果。图10为实施例8中乙型脑炎病毒E218A对干扰素的敏感性测定步骤2的结果。图11为实施例9中乙型脑炎病毒E218A的免疫原性的结果。图12为实施例10中乙型脑炎E218A重组病毒的免疫保护性的结果。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蛋白质，是将序列表的序列3所示蛋白质自N末端第218位氨基酸残基由极性氨基酸突变为非极性氨基酸后得到的蛋白质。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：秦成峰，史佩勇，李世华，李晓峰，赵慧，秦鄂德，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：
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