本发明专利技术涉及一种表达鸡毒支原体TM1蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，更具体地，重组新城疫LaSota弱毒疫苗是rLa-tPA-TM1。本发明专利技术还公开了制备所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法和该重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备预防鸡毒支原体引起的疾病和新城疫的双价疫苗中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及重组病毒疫苗领域，更具体地，本专利技术涉及一种表达鸡毒支原体TMl蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，更具体地，重组新城疫LaSota弱毒疫苗是rLa-tPA-TMl。本专利技术还公开了制备所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法和该重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备预防鸡毒支原体引起的疾病和新城疫的双价疫苗中的应用。
技术介绍
鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum, MG)可引起感染鸡的慢性呼吸道病,气囊炎和窦炎，是当前影响养禽业生产的常见疾病之一。发病鸡多表现呼吸困难、咳嗽和口罗音，常见有眶下窦炎、气囊炎等。本病流行于世界各国，随着现代养鸡规模不断加大、饲养方式改变和饲养密度日益提高，该病发病率越来越高，所有日龄的鸡均可感染，3周内雏鸡更 为易感。主要影响雏鸡生长、使成年鸡产蛋减少。冀锡霖等在1986年所作的流行病学调查表明我国20个省、市的鸡群中鸡毒支原体阳性感染率接近80%。MG污染鸡场很难根除，导致种蛋孵化率低，雏禽品质差，而且世代相传，危害性日益突出，受到养鸡业者的普遍关注OMG可以通过疫苗接种进行预防。目前国内采用弱毒苗和灭活疫苗进行预防接种。江苏省农科院兽医研究所邵国青研究员对MG弱毒疫苗进行过系统研究，曾对SC株的免疫原性进行评估，研究结果显示免疫10天后攻毒保护率达80 %。由于有的毒株其致病力极弱，需反复免疫，保护效果不佳；而有的弱毒疫苗株仍具有一定毒力，特别对于火鸡，它可以引起商品火鸡感染发病。MG弱毒常常发生置换和传播，因此可能会加重MG控制和清除的难度m。弱毒疫苗的应用在一定程度上控制了 MG的流行，但在使用过程中存在一定的问题。几十年前许多禽病工作者已经开始着手灭活疫苗研究，但效果不佳。Yoder等报道了以MG油乳剂灭活苗对15 30日龄鸡免疫接种能有效地抵抗强毒株攻击，但用于10日龄以前的雏鸡，免疫效果不理想，无法诱导保护性抗体。宋勤叶等用MG油乳剂灭活苗接种蛋鸡，结果表明无论在试验攻毒前还是在攻毒后接种，只能有效地降低MG经蛋传播的比率。宁宜宝等通过高速离心或是中空纤维滤器浓缩鸡毒支原体作为灭活疫苗使用，研究发现5倍浓缩的疫苗可以使鸡产生良好的免疫力，免疫力随着抗原浓度的提高而提高，不浓缩的原液培养物所制备的疫苗几乎不能诱导鸡产生免疫保护力。浓缩抗原在提高免疫原性的同时大大增加了疫苗成本，使得原本昂贵的灭活疫苗价格更上一层楼。在生产实践中，很多鸡场应用抗生素来治疗和控制MG的感染和扩散。药物治疗不能完全清除支原体的感染，并存在药物残留的弊端，阻碍禽类产品出口。因此，研究廉价、安全、高效的鸡毒支原体疫苗具有积极的现实意义。因此，目前用于防治MG的灭活疫苗和弱毒疫苗均存在不同程度的不足。而且MG培养困难，不同区域分离的毒株抗原性差异较大，常规疫苗在防治MG上已经力不从心，因此利用先进技术手段开发新型疫苗已经迫在眉睫，而MG基因工程疫苗的研制一直处于初级阶段。新城疫病毒(NDV)载体系统是近年进展迅速的活病毒载体系统，作为外源基因的表达载体具有非凡的优势。NDV可同时诱导体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫，是所有疫苗形式中最为理想的免疫方式；经过多年的临床应用检验，NDV遗传相对稳定，毒株间发生重组及毒力返强可能性极小，使用安全、方便；NDV具有高滴度的鸡胚生长特性，生产成本低廉，便于规模化生产。NDV基因组全长15186核苷酸，与其它副粘病毒一样，包括核蛋白(NP)，磷蛋白(P)，基质蛋白(M)，融合蛋白(F)，凝集素神经氨酸酶蛋白(HN)，和大聚合酶蛋白(L)六个独立转录编码单元。负链RNA病毒的反向遗传操作(Reverse genetic)是通过操作病毒基因组cDNA制造新病毒的过程，其基本过程是①组装完整的病毒基因组(或重组型基因组)cDNA克隆，5’末端精确地缀于T7启动子后，3’末端精确缀于自我剪切的核酸酶序列和T7转录终止信号之前，构成基因组cDNA转录模板；②以基因组cDNA转录模板与启动病毒复制必须的 转录相关功能结构蛋白如核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的表达质粒(T7启动子)一起，共转染整合表达T7聚合酶的病毒复制许可细胞24-72小时后收获培养上清，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获(rescue)病毒。对基因组cDNA进行突变、缺失或外源基因插入修饰后，通过反向遗传操作系统(reverse genetic system,RGS系统)可获得相应的突变或重组的负链RNA病毒。申请人:之前获得授权的中国专利“新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用” (ZL200510097997. 8, CN1293195C,申请日2005年9月2日)已经建立了一种新城疫LaSota弱毒疫苗株的反向遗传操作系统,并且成功救获了野生型病毒株，并且为进一步开展新城疫病毒活载体疫苗研制及NDV病毒相关基础研究奠定了坚实的基础。
技术实现思路
MG其基因组中的一个开放阅读框TM-I表达一个29kDa的多肽。本专利技术利用NDV疫苗株LaSota作为载体表达MG结构蛋白的经密码子人工优化后的TM-I基因，拯救重组病毒并进行免疫试验，结果发现可以诱导雏鸡产生保护性抗体，由此探索了活载体疫苗控制MG流行的可行性。更具体地，本专利技术以NDV弱毒LaSota疫苗株为表达载体，以MG疫苗株作为基因供体，利用反向遗传操作技术，成功拯救表达MG tPA-TMl蛋白的重组新城疫病毒。重组病毒在SPF雏鸡上进行免疫评价，ELISA抗体检测结果证明重组疫苗免疫可以诱导产生显著的抗体反应，此重组疫苗将MG的预防与NDV的免疫合二为一，一次免疫防治两种疫病，在不增加防疫成本的情况下完成另一严重威胁禽类养殖的重要疫病的防控，重组活载体二联疫苗rLa-tPA-TMl可以作为预防NDV和MG的二联活疫苗使用。因此，本专利技术的一个目的是提供一种表达编码鸡毒支原体TMl蛋白的基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗(即表达鸡毒支原体TMl蛋白的新城疫LaSota弱毒疫苗)。在一个实施方案中，所述鸡毒支原体TMl蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。在另一个实施方案中，所述编码鸡毒支原体TMl蛋白的基因的序列是密码子优化后的序列，优选如SEQ ID No. 2所示(SEQ ID No. 5是鸡毒支原体TMl基因的天然序列)。在另一个实施方案中，在所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗中，在TMl蛋白编码基因的3'端引入人组织型纤溶酶原激活因子(tPA)序列作为信号肽，优选所述tPA序列如SEQ ID No. 3 所示。在另一个实施方案中，所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗为rLa_tPA_TMl。本专利技术还有一个目的是提供本专利技术的重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备预防鸡毒支原体引起的疾病和新城疫的双价疫苗中的应用。本专利技术还有一个目的是提供一种生产本专利技术的重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法，该方法包括(I)构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入编码鸡毒支原体TMl蛋白的基因的所述新城疫LaSota弱毒疫苗的基因组cDNA序列； (2)构建一个或多个转录辅助质粒，该辅助质粒包括编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达编码鸡毒支原体(Mycoplasma？gallisepticum，MG)TM1蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，优选编码所述TM1蛋白的基因被插入在新城疫LaSota弱毒疫苗基因组中的P和M基因之间。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：步志高，陈化兰，葛金英，邵国青，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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