异二聚体结合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术提供通过免疫球蛋白CH1区和免疫球蛋白轻链恒定区（CL）的自然异二聚化，在两个不同单链融合多肽之间形成的多肽异二聚体。多肽异二聚体包含两个或多个特异结合一个或多个靶标（如受体）的结合域。另外，异二聚体的两个链还包含Fc区部分。本发明专利技术也提供核酸、载体、宿主细胞和制备多肽异二聚体的方法，和使用所述异二聚体的方法，例如指导T细胞活化，抑制实体肿瘤生长和治疗自体免疫或炎症病症。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉参考本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2009年12月29日提交的美国临时专利申请号61/290,840和2010年7月16日提交的美国临时专利申请号61/365,266的优先权；其全文各自通过引用纳入本文。关于序列表的声明本申请的相关序列表以文本格式代替纸件副本提供，由此通过引用纳入说明书。包含序列表的文本名称为910180_422PC_SEQUENCE_LISTING.txt。所述文本文件为839KB，创建于2010年12月29日，通过EFS-Web以电子方式提交，与说明书一并提交申请。背景
本专利技术一般提供多肽异二聚体、其合成物、以及制备和使用所述多肽异二聚体的方法。更具体而言，本文提供的多肽异二聚体部分通过在免疫球蛋白CH1区和免疫球蛋白轻链恒定区（CL）之间的自然异二聚化形成。另外，本文提供的多肽异二聚体包含能特异结合一个或多个靶标的两个或多个结合域。再者，本文提供的多肽异二聚体的单链多肽，每个包括Fc区部分（即免疫球蛋白CH2和CH3域）。
技术介绍
信号转导过程经常涉及有胞外域、跨膜域和胞内域的受体蛋白。配体结合中，细胞表面受体分子经常寡聚化或多聚化（也称为“交联”）以有效传递信号到细胞的胞内部分。对所述受体和配体相互作用或随后受体寡聚化或多聚化的刺激或阻止对多种疾病有重要治疗应用。用于调节受体和配体结合的示例分子包括抗体和从抗体衍生的分子。例如，抗体或其衍生物作为细胞表面结合受体的受体拮抗剂并且通过阻止与活性配体的结合位点或抑制活性所需的受体寡聚化或多聚化使其失活。其他某些示例下，抗体或其衍生物作为激动剂，通过结合或交联多个膜受体，模仿天然配体功能。另一个示例是双特异性抗体衍生物，可用于指导细胞毒性试剂或免疫效应细胞至靶位点，如肿瘤。双特异性抗体是基于抗体的分子，能同时结合两个分离的并不同的抗原（或相同抗原的不同表位）。双特异性抗体的一个用途是重新引导细胞毒性免疫效应细胞，通过抗体依赖细胞毒性（ADCC）以增强对肿瘤细胞的杀伤。本文中，双特异性抗体的一个臂结合肿瘤细胞的抗原，并且另一个臂结合效应细胞表达的决定簇。通过交联肿瘤和效应细胞，所述双特异性抗体不仅在肿瘤细胞周围引入效应细胞，而且也同时引起其活化，造成有效杀死肿瘤细胞。双特异性抗体已经用于在肿瘤组织富集化学或放射治疗试剂以最小化对正常组织的有害作用。这种情况下，双特异性抗体的一个臂与要破坏的靶向细胞所表达的抗原相结合，另一个臂运输化疗药物、放射性同位素或毒素。通常开发双特异性抗体的一个主要障碍是难于为临床前和临床研究生产足质足量的材料。起初，双特异性抗体生产的主要途径是通过在单个细胞中共表达不同特异性的两个亲代抗体的两个轻链和两个重链。然而，具有所需结合能力的双特异性抗体产量较少，并且非常难以从其它产品中纯化。另一个双特异性抗体生产的传统方法是将不同特异性的两个抗体或其片段进行化学连接。然而，该方法也复杂，并且化学修饰过程可以使抗体失活或促进聚集。因为难以从不需要的产物中进行纯化，所得双特异性抗体的低产率和差质量使得所述过程不适合作为临床开发所需的大规模生产。近期，多种异二聚化技术已经用于提高双特异性抗体的生产。然而，单个异二聚体域如Jun/Fos卷曲螺旋到scFv域的融合造成同或异二聚体的混合和需要重新折叠组装（de Kruif和Logtenberg，J.Biol.Chem.271:7630-4，1996）。scFv片段到全抗体的融合也用作二聚化设备（Coloma和Morrison，Nat.Biotechnol.15:159-63，1997）。然而，所述融合得到的大分子实体组织穿透能力差。两个scFv片段一起的融合已经用于产生双特异性蛋白（如马里兰州贝塞斯达Micromet公司的抗体，美国专利号7,635,472）。然而，所述蛋白不含Fc区，并且因此无法通过Fc区进行活性操作。另外，所述蛋白小（~55kDa）并且因此在血清中的半衰期相对短。至今，免疫球蛋白融合技术没有提供市售可得异二聚蛋白或生产方法。因此，本领域仍需要其它多特异异二聚蛋白以及有效的生产方法。
技术实现思路
本专利技术提供通过免疫球蛋白CH1区和免疫球蛋白轻链恒定区（CL）的自然异二聚化在两个不同单链多肽之间形成的多肽异二聚体。本专利技术也提供核酸、载体、宿主细胞和制备多肽异二聚体的方法，和使用所述异二聚体的方法，例如在指导T细胞活化，抑制实体肿瘤生长，治疗自体免疫或感染病症或治疗B细胞相关紊乱或疾病。一方面，本专利技术提供多肽异二聚体，所述多肽异二聚体包括（a）第一个单链多肽（SCP-I），包含1-4个特异结合1-4个靶标的结合域，铰链（H-I），免疫球蛋白异二聚化域（HD-I）和Fc区部分（FRP-I）；和（b）第二个单链多肽（SCP-II），包含0-4个特异结合0-4个靶标的结合域（SCP-II），铰链（H-II），免疫球蛋白异二聚化域（HD-II）和Fc区部分（FRP-II）；其中（i）免疫球蛋白HD-I和免疫球蛋白HD-II优选互相结合以形成包含SCP-I和SCP-II的多肽异二聚体，和（1）第一单链多肽的免疫球蛋白异二聚体域（HD-I）包含第一免疫球蛋白CH1域，和第二单链多肽的免疫球蛋白异二聚体域（HD-II）包含第一免疫球蛋白CL域，或（2）第一单链多肽的免疫球蛋白异二聚体域（HD-I）包括第一免疫球蛋白CL域，和第二单链多肽的免疫球蛋白异二聚体域（HD-II）包含第一免疫球蛋白CH1域；和（ii）SCP-I的Fc区部分和SCP-II的Fc区部分包含第二单链多肽的免疫球蛋白异二聚体域（HD-II）包括第一免疫球蛋白包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD或其任意组合的免疫球蛋白CH2和CH3域；IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM或其任意组合的一个或两个免疫球蛋白CH3域；或IgE、IgM或其任意组合的免疫球蛋白CH3和CH4域，前提是多肽异二聚体包含至少特异结合靶标（如至少两个不同靶标）的两个结合域。某些实施方式中，多肽异二聚体的结合域是单链Fv（scFv）多肽。某些实施方式中，多肽异二聚体包括两个结合域（BD1和BD2）。一个实施方式中，两个结合域（BD1和BD2）都在第一单链多肽（SCP-I）上，并且其中HD-I和FRP-I位于BD1和BD2之间。另一个实施方式中，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.12.29 US 61/290,840;2010.07.16 US 61/365,266;1.一种多肽异二聚体，所述多肽异二聚体包含：
(a)第一单链多肽（SCP-I），其含有特异结合1-4个靶标的1-4个结合域，
铰链（H-I），免疫球蛋白异二聚化域（HD-I）和Fc区部分（FRP-I）；和
(b)第二个单链多肽（SCP-II），其含有特异结合0-4个靶标的0-4个结合
域，铰链（H-II），免疫球蛋白异二聚化域（HD-II）和Fc区部分（FRP-II）；
其中
(i)第一单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域（HD-I）和第二单链多肽
的免疫球蛋白异二聚化域（HD-II）优先互相结合以形成含有第一单链多
肽（SCP-I）和第二单链多肽（SCP-II）的多肽异二聚体，和
(1)第一单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域（HD-I）包含第一免
疫球蛋白CH1区，并且第二单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域
（HD-II）包含第一免疫球蛋白CL区，或
(2)第一单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域（HD-I）包含第一免
疫球蛋白CL区，并且第二单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域
（HD-II）包含第一免疫球蛋白CH1区；和
(ii)第一单链多肽的Fc区部分（FCP-I）和第二单链多肽的Fc区部
分（FCP-II）每个包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD或
其组合的免疫球蛋白的CH2和CH3域；IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、
IgA2、IgD、IgE、IgM或其组合的免疫球蛋白的CH3域；或IgE、IgM或
其组合的免疫球蛋白的CH3和CH4域，
前提是多肽异二聚体包含至少两个特异结合至少两个不同靶标的结合域。
2.如权利要求1所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述结合域是单链
Fv(scFv)多肽。
3.如权利要求1所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述多肽异二聚体包
含两个结合域（BD1和BD2）。
4.如权利要求3所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述两个结合域（BD1
和BD2）都在第一单链多肽（SCP-I）上，并且其中HD-I和FRP-I设置在BD1
和BD2之间。
5.如权利要求3所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一结合域
（BD1）在第一单链多肽（SCP-I）上，并且所述第二结合域（BD2）在第二单
链多肽（SCP-II）上。
6.如权利要求5所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一结合域
（BD1）在第一单链多肽的Fc区部分（FRP-I）的氨基末端，并且第二结合域
（BD2）在第二单链多肽的Fc区部分（FRP-II）的氨基末端。
7.如权利要求5所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一结合域
（BD1）在第一单链多肽的Fc区部分（FRP-I）的氨基末端，并且第二结合域
（BD2）在第二单链多肽的Fc区部分（FRP-II）的羧基末端。
8.如权利要求5所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一结合域
（BD1）在第一单链多肽的Fc区部分（FRP-I）的羧基末端，并且第二结合域
（BD2）在第二单链多肽的Fc区部分（FRP-II）的羧基末端。
9.如权利要求1所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述多肽异二聚体包
含三个结合域（BD1、BD2和BD3）。
10.如权利要求9所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述HD-I和FRP-I
设置在BD1和BD2之间，并且第三结合域（BD3）在第二单链多肽的Fc区部
分（FRP-II）的氨基末端。
11.如权利要求9所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述HD-I和FRP-I
设置在BD1和BD2之间，并且第三结合域（BD3）在第二单链多肽的Fc区部
分（FRP-II）的羧基末端。
12.如权利要求1所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述多肽异二聚
体包含四个结合域（BD1、BD2、BD3和BD4）。
13.如权利要求12所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述HD-I和
FRP-I设置在BD1和BD2之间，并且HD-II和FRP-II设置在BD3和BD4之
间。
14.如权利要求1所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述多肽异二聚
体包含5-8个结合域。
15.如权利要求1-14中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述
多肽异二聚体的至少一个结合域特异结合下列分子或是其拮抗剂：TCRα、

\tTCRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD28、CD79b、超级IL-6、单IL-、CD86、CD20、
PSMA、CD19、HLA-DR、Ron、c-Met、CEACAM-6、LIGHT、GITRL、CD40、
PDL1、PDL2、HVEM、LTBR、EGFR、EGFRvIII、ErbB2、ErbB3、ErbB4、
IGF1R、EphA2、PDGFR、VEGFR1-4、促血管生成素2、CD64、CD32A、CD16、
CD71、TNFR1、TNFR2、TWEAKR、TACI、BAFF-R、BCMA、FAS、CD32B、
CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD70、TNFα、IL-6、超级IL-6、
IL-2、IL-1、IL-7、IL-8、IL-17A/C、IP-10、IFNγ、IFNα、RANKL、FASL、
TGFβ、IL10、IL17A/F、CSF2、IGF1、IGF2、BLyS/APRIL、HGF、MSP、
EGF（包括epiregulin、herregulin、β-regulin、神经调节蛋白)、HIF-1α、VEGFA、
VEGFB、VEGFC、VEGFD、TNFα、Wnt、sHH、TGFβ、PDGF、TWEAK、
EpCAM、CEA、PCTA-1、STEAP-1、PSCA、ALCAM（CD166）、EphA2、
CD151、CA-125、MUC-1、MAGE-1、TROP2、CCR5、HER-3、HER-4、EGFR、
CEA、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5b、MUC7、βhCG、Lewis-Y、
神经节苷脂GD3、9-O-乙酰基-GD3、GM2、Globo H、岩藻糖GM1、聚SA、
GD2、碳脱水酶IX(MN/CA IX)、CD44v6、Sonic Hedgehog（Shh）、Wue-1、
血浆细胞抗原、（膜结合）IgE、黑色素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖（MCSP）、CCR8、
TNFα前提、STEAP、间皮素、A33抗原、前列腺干细胞抗原（PSCA）、Ly-6；
桥粒核心糖蛋白4、E-钙粘蛋白新表位、胎儿乙酰基胆碱受体、CD25、CA19-9
标记、CA-125标记和缪勒管激素抑制因子（Muellerian Inhibitory Substance
（MIS））受体II、sTn（唾酸化Tn抗原；TAG-72）、FAP（成纤维细胞活化）、
內皮唾酸蛋白、EGFRvIII、LG、SAS、CD63、IGF1R、CD151、TGFBR2、GHRHR、
GHR、IL-6R、gp130、TNFR2、OSMRβ、Patched-1、卷曲蛋白（Frizzled）、
Robo1、CD80、CD81、CD86、OX40、CD40、CD137、LIFRβ、TLR7或TLR9。
16.如权利要求1-6中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述
至少一个结合域是IL-10、HLA-G、HGF、IL-35、PD-1、BTLA、TNFR1、TNFR2、
DR4、DR5、TWEAKR或FAS的激动剂。
17.如权利要求1-6中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述
至少一个结合域特异结合TCR复合物或其成分，并且至少另一个结合域特异
结合PSMA、CD79b、CD19、HLA-DR、CD20、RON、c-Met或CEACAM-6。
18.如权利要求1-6中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述
至少一个结合域特异结合CD28，并且至少另一个结合域特异结合CD79b、超
级IL-6、PDL2、单IL-10、CD86、LIGHT、GITRL、CD40、PDL1、HVEM或
LTBR，或是其拮抗剂。
19.如权利要求1-6中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述
至少一个结合域特异结合CD28，并且至少另一个结合域是IL-10、HLA-G、
HGF、IL-35、PD-1或BTLA的激动剂。
20.如权利要求1-19中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述
第一单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域（HD-I）包含第一免疫球蛋白CH1区，
并且第二单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域（HD-II）包含第一免疫球蛋白CL
区。
21.如权利要求20所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一CH1
区是第一单链多肽的Fc区部分的氨基末端，并且第一CL区是第二单链多肽的
Fc区部分的氨基末端。
22.如权利要求20所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一CH1
区是第一单链多肽的Fc区部分的羧基末端，并且第一CL区是第二单链多肽的
Fc区部分的羧基末端。
23.如权利要求20所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一单链
多肽还包含第二CH1区且第二单链多肽还包含第二CL区，并且第一单链多肽
的第二CH1区和第二单链多肽的第二CL区在多肽异二聚体中互相结合。
24.如权利要求23所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一单链
多肽的Fc区部分设置在第一和第二CH1区之间，并且其中第二单链多肽的Fc
区部分设置在第一和第二CL区之间。
25.如权利要求23所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一和第
二CH1区都在第一单链多肽的Fc区部分的氨基末端，和第一和第二CL区都
在第二单链多肽的Fc区部分的氨基末端。
26.如权利要求23所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一和第
二CH1区都在第一单链多肽的Fc区部分的羧基末端，并且第一和第二CL区
都在第二单链多肽的Fc区部分的羧基末端。
27.如权利要求1-19中任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述
第一单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域（HD-I）包含第一免疫球蛋白CL区，
并且第二单链多肽的免疫球蛋白异二聚化域（HD-II）包含第一免疫球蛋白CH1
区。
28.如权利要求27所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一CL区
是第一单链多肽的Fc区部分的氨基末端，并且第一CH1区是第二单链多肽的
Fc区部分的氨基末端。
29.如权利要求27所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一CL区
是第一单链多肽的Fc区部分的羧基末端，并且第一CH1区是第二单链多肽的
Fc区部分的羧基末端。
30.如权利要求27所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一单链
多肽还包含第二CL区和第二单链多肽还包含第二CH1区，并且第一单链多肽
的第二CL区和第二单链多肽的第二CH1区在多肽异二聚体中互相结合。
31.如权利要求30所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一单链
多肽的Fc区部分设置在第一和第二CL区之间，并且其中第二单链多肽的Fc
区部分设置在第一和第二CH1区之间。
32.如权利要求30所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一和第
二CL区都位于第一单链多肽的Fc区部分的氨基末端，并且第一和第二CH1
区都位于第二单链多肽的Fc区部分的氨基末端。
33.如权利要求30所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一和第
二CL区都位于第一单链多肽的Fc区部分的羧基末端，并且第一和第二CH1
区都位于第二单链多肽的Fc区部分的羧基末端。
34.如权利要求20所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第一单链
多肽还包含第二CL区和第二单链多肽还包含第二CH1区，并且第一单链多肽
的第二CL区和第二单链多肽的第二CH1区在多肽异二聚体中互相结合。
35.如权利要求34所述的多肽异二聚体，其特征在于，
(a)第一单链多肽中，第一CH1区是Fc区部分的氨基末端，并且第二CL
区是Fc区部分的羧基末端，和
(b)第二单链多肽中，第一CL区是Fc区部分的氨基末端，并且第二CH1
区是Fc区部分的羧基末端。
36.如权利要求34所述的多肽异二聚体，其特征在于，
(a)第一单链多肽中，第一CH1区是Fc区部分的羧基末端，并且第二CL
区是Fc区部分的氨基末端，和
(b)第二单链多肽中，第一CL区是Fc区部分的羧基末端，并且第二CH1
区是Fc区部分的氨基末端。
37.如权利要求34所述的多肽异二聚体，其特征在于，
(a)第一单链多肽中，第一CH1区和第二CL区都是Fc区部分的氨基末
端，并且第一CH1区是第二CL区的氨基末端，和
(b)第二单链多肽中，第一CL区和第二CH1区都是Fc区部分的氨基末
端，并且第一CL区是第二CH1区的氨基末端。
38.如权利要求34所述的多肽异二聚体，其特征在于，
(a)第一单链多肽中，第一CH1区和第二CL区都是Fc区部分的氨基末
端，并且第二CL区是第一CH1区的氨基末端，和
(b)第二单链多肽中，第一CL区和第二CH1区都是Fc区部分的氨基末
端，并且第二CH1区是第一CL区的氨基末端。
39.如权利要求34所述的多肽异二聚体，其特征在于，
(a)第一单链多肽中，第一CH1区和第二CL区都是Fc区部分的羧基末
端，并且第一CH1区是第二CL区的氨基末端，和
(b)第二单链多肽中，第一CL区和第二CH1区都是Fc区部分的羧基末
端，并且第一CL区是第二CH1区的氨基末端。
40.如权利要求34所述的多肽异二聚体，其特征在于，
(a)第一单链多肽中，第一CH1区和第二CL区都是Fc区部分的羧基末
端，并且第二CL区是第一CH1区的氨基末端，和
(b)第二单链多肽中，第一CL区和第二CH1区都是Fc区部分的羧基末
端，并且第二CH1区是第一CL区的氨基末端。
41.如权利要求1-40任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第
一CL区是Cκ区。
42.如权利要求1-40任一项所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述第
一CL区是Cλ区。
43.如权利要求24-27和31-41中任一项所述的多肽异二聚体，其特征
在于，所述第二CL区是Cκ区。
44.如权利要求23-26和30-40中任一项所述的多肽异二聚体，其特征
在于，所述第二CL区是Cλ区。
45.如权利要求41或43所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述Cκ
区是野生型人免疫球蛋白Cκ区。
46.如权利要求41或43所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述Cκ
区是野生型人Cκ区在N29、N30、Q52、V55、T56、T56、S68或T70发生一
个或多个氨基酸替换的改变了的人免疫球蛋白Cκ区。
47.如权利要求46所述的多肽异二聚体，其特征在于，所述一个或多
个氨基酸替换选自Ala(A)、Arg(R)、Trp(W)、Tyr(Y)、Gl...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·W·布兰肯希普，P·谭，
申请(专利权)人：新兴产品开发西雅图有限公司，
类型：
国别省市：