本发明专利技术公开了一种转基因大豆品系RRS?PCR-DHPLC检测引物及检测方法，所述引物具有较强的特异性，能够用于PCR扩增以及DHPLC分析。所述检测方法提供了一种操作简便、扩展性能好、灵敏度高的转基因大豆品系RRS检测方法。利用DHPLC对PCR扩增产物进行分析，其片段大小区分率可达数个碱基，分辨率高。本发明专利技术的引物和检测方法为转基因大豆品系RRS检测提供了一种简单、方便、有效、可靠的检测方法，特别适合用于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种转基因产品 的检测，特别是涉及一种转基因大豆品系的PCR-DHPLC检测弓I物及检测方法。
技术介绍
目前，全球转基因作物种植面积正迅猛增长。转基因大豆依然是最主要的转基因作物，种植面积占全球转基因作物总种植面积的一半以上。我国近年进口大豆的数量逐年增加。随着转基因作物种植面积的不断扩大，转基因作物及其食品的环境释放安全性及食用安全性也受到越来越广泛的关注。我国政府于2002年实施的《农业转基因生物安全评价管理办法》、《农业转基因生物进口安全管理办法》、《农业转基因生物标识管理办法》列出了第一批标识管理的转基因食品，转基因大豆名列首位。面对如此大批量的进口大豆，更需要快速、简便、可靠的转基因检测技术。目前的检测方法中以常规PCR、实时荧光PCR等最为方便快捷。但是对于常规PCR，其检测结果分析通常采用电泳分析，最常见的即凝胶电泳分析，这种分析方法分辨率不高，操作繁琐，需要制胶、点样、电泳、照相等，并且这些过程目前都无法实现自动化操作，工作量大。而实时荧光PCR由于目前仪器自身及荧光染料研制的限制，仅能同时提供互不干扰的4个荧光通道，也限制了该技术在检测通量扩展。变性高效液相色谱分析检测(DenaturingHigh-performance LiquidChromatography, DHPLC)是一种特异性强、分辨率高、重复性好、扩展性能好的分析检测方法。该方法可一次同时分析多个样品，对满足口岸检疫工作需要、提升转基因产品的检测水平，加强我国对进境植物及其产品中转基因成分的检疫监管、保护我国作物的生产安全具有重要意义。目前，尚没有转基因大豆品系RRS的PCR结合DHPLC检测技术(PCR-DHPLC)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于转基因大豆品系RRS的PCR-DHPLC检测的引物。本专利技术的另一目的是提供一种基于上述引物的扩展性能好、灵敏度和分辨率高的转基因大豆品系RRS的PCR-DHPLC检测方法。为实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案本专利技术公开了用于转基因大豆品系RRS PCR-DHPLC检测的引物，所述引物包括引物对2，引物对2的上游引物含有Seq ID No. 3所示序列，下游引物含有Seq ID No. 4所示序列；Seq ID No. 3 :5’ -CGTGGCCTCGCGATCTGACTTCAATTTAACCGATGCTAATGAGTT-3’Seq ID No. 4 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGATGCGAAGGATAGTGGGATTGT-3，。进一步的，所述引物还包括引物对1，引物对I的上游引物含有Seq ID No. I所示序列，下游引物含有Seq ID No. 2所示序列；Seq ID No. I :5，-TCCTCCAAGGAGACGCTATTG-3，Seq ID No. 2 :5’ -GGTTTTGGGGTGCCGTTT-3’。更进一步的，所述引物对I的上游引物5’端还包括Seq ID No. 5所示序列，下游引物5’端还包括Seq ID No. 6所示序列；Seq ID No. 5 :5，-CGTGGCCTCGCGATCTGACT-3’Seq ID No. 6 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGA-3，。需要指出的是，上述Seq ID No. 5和Seq ID No. 6是分别在上游引物和下游引物的5’端添加的与检测靶标序列无关的两段序列，该两段序列可以是与检测靶标序列同源性很远的其它物种的序列，也可以是随机生成的序列。该两段序列作为调控序列，可以用于控制PCR扩增产物的大小，以便于PCR扩增产物的进一步分析。 本专利技术中，优选的，所述引物对I的上游引物具有Seq ID No.7所示序列，下游引物具有Seq ID No. 8所示序列；引物对2的上游引物具有Seq ID No. 3所示序列，下游引物具有Seq ID No. 4所示序列；Seq ID No. 7 :5’ -CGTGGCCTCGCGATCTGACTTCCTCCAAGGAGACGCTATTG-3’Seq ID No. 8 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGAGGTTTTGGGGTGCCGTTT-3，。需要说明的是，所述Seq ID No. 7和Seq ID No. 8序列是由上述Seq ID No. I和Seq ID No. 2序列分别在其5’端添加调控序列而成,所述Seq ID No. 3和Seq ID No. 4序列的5’端前20个碱基也是调控序列。尽管上述已经说明Seq ID No. 5和Seq ID No. 6所示调控序列可以是随机生成的序列，但是，并不是任意序列都可以添加，具体到本专利技术中，需要考虑调控序列与设计的特异性位点序列理化性质的统一协调，并且还需要考虑添加调控序列后的引物作为检测引物的整体性能。本专利技术中，更优选的，所述引物对I为检测大豆内源基因Lectin基因的引物，引物对2为检测转基因大豆品系RRS的引物。本专利技术还公开了一种用于转基因大豆品系RRS的PCR-DHPLC检测方法，所述检测方法包括采用上述的引物对I和2中的至少一对引物，以大豆DNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行变性高效液相色谱分析。进一步的,所述检测方法还包括以marker为参考标准进行变性高效液相色谱分析，将PCR扩增产物的变性高效液相色谱分析结果与marker的变性高效液相色谱分析结果进行比对。优选的上述检测方法包括如下步骤(A)采用所述引物，以大豆DNA为模板，进行PCR扩增；(B)以步骤(A)的PCR扩增产物为样品进行DHPLC分析，同时以marker为参考标准进行DHPLC分析；(C)将步骤⑶中样品的DHPLC分析结果与marker的DHPLC分析结果进行比较，确定样品的分子量大小，从而判断是否含有检测的靶标序列。由于采用以上技术方案，本专利技术的有益效果在于本专利技术的转基因大豆RRS品系检测引物具有较强的特异性，能够用于后续的PCR扩增以及DHPLC分析。本专利技术将PCR与DHPLC相结合，提供了一种操作简便、扩展性能好、灵敏度高的转基因大豆品系RRS检测方法，能够实现转基因大豆品系RRS的多靶标检测。利用DHPLC对PCR扩增产物进行分析，对不同大小的PCR产物片段区分率可达数个碱基，分辨率高。本专利技术的引物和检测方法为转基因大豆品系RRS检测提供了一种简单、方便、有效、可靠的检测方法，特别适合用于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。附图说明图I至图3为本专利技术实施例中DHPLC分析的部分结果，其中I为非转基因大豆、2为转基因大豆256043、3为转基因大豆A2704-12、4为转基因大豆305423、5为转基因大豆M0N89788、6为转基因大豆A5547_127、7为转基因大豆RRS品系GTS-4_3-2、9_12为阴性对照，分别为玉米、油菜、水稻、棉花的DNA ；marker-puc为puc18marker,marker的各峰值从左至右依次为 80bp、102bp、174bp、257bp、267bp、296bp、434bp、458bp、587bp。 具体实施例方式本专利技术公布了用于转基因大豆品系RRS的PCR-DHPLC检测的引物本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于转基因大豆品系RRS?PCR?DHPLC检测的引物，其特征在于：所述引物包括引物对2，引物对2的上游引物含有Seq?ID?No.3所示序列，下游引物含有Seq?ID?No.4所示序列；Seq?ID?No.3：5’?CGTGGCCTCGCGATCTGACTTCAATTTAACCGATGCTAATGAGTT?3’Seq?ID?No.4：5’?CTCAGCGGCGGAGCTACAGATGCGAAGGATAGTGGGATTGT?3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：章桂明，向才玉，凌杏园，潘广，程颖慧，康林，李鹤遥，
申请(专利权)人：深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：
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