一种检测非编码小RNA的方法技术

本发明专利技术提供了一种检测非编码小RNA的方法，寡核苷酸序列探针在末端转移酶作用下3’末端标记非同位素；将已标记探针和样品RNA置于液相杂交环境充分反应使样品中目的非编码小RNA和探针形成杂化双链。之后将杂交产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离结合为双链的RNA-探针和未杂交的过量探针，之后在转移至尼龙膜，经紫外线交联固定，加入链霉亲和素-HRP即可显色发光。在体系中，杂交后的目的RNA-探针与单一未杂交探针均能通过链霉亲和素-HRP，加入酶底物发出荧光条带，在X线光片显影。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测非编码小RNA的方法，尤其涉及一种应用非同位素标记探针液相杂交检测非编码小RNA的方法。
技术介绍
非编码小RAN (small non-messenger RNA,本专利技术也称为小RNA)是细胞中一大类由几十核苷酸到几百核苷酸组成的、不编码蛋白质的RNA，如核小RNA、核仁RNA、微RNA、干扰小RNA、时序小RNA等，这类RNA本身或与蛋白质结合形成复合体有重要的生物学功能，研究发现，小RNA在生物体内细胞、组织等的发育、生长、分化、甚至疾病的发生以及病毒的入侵和防御方面发挥着至关重要的作用。目前可用于检测小RNA的技术主要有Northern blot、RT-PCR及微阵列芯片技术。PCR技术如《实时荧光定量PCR方法检测小RNA》(中国细胞生物学学报，2010，32 (3)359 360)公开的定量检测小RNA的方法，微阵列芯片技术如CN101182576A公开的用于胃组织的微RNA探针和以及检测微RNA的方法。尽管RT-PCR、微阵列技术检在测小RNA时与Northern blot技术相比较具有较高灵敏度,但是传统的Northern blot方法不仅可以直接检出待测的RNA，而且能明确RNA的碱基数目，同时也可进行半定量测定，所以传统的Northern blot仍是检测非编码小RNA的金标准。应用传统的Northern blot技术检测非编码小RNA包括变性聚丙烯酰胺胶分离小RNA片段、将小RNA转移至尼龙膜或硝酸纤维素膜、预杂交、同位素探针杂交、检测等。整个过程步骤繁琐，耗时长，需要2-3天才能完成；更为重要的是检测过程中应用到同位素，这需要特定的操作场所、仪器设备及相关专业人员，这些不足大大限制了其推广及应用。因此有人应用非同位素标记探针(生物素标记探针)来替代同位素标记的探针，虽然避免了同位素不利的方面，但是繁琐的操作过程并未减少，检测信号的时间仍未缩短。众所周知，RNA酶无处不在，繁琐的操作增加了小RNA被RNA酶降解的风险，不可避免降低了传统Northernblot技术检测小RNA的敏感性，尤其加大了对低丰度非编码小RNA检测的难度。
技术实现思路
为了克服传统Northern blot技术在检测非编码小RNA方面的不足，拓展Northern blot技术在检测非编码小RNA方面的应用，本专利技术创造提供一种新型的优化方案，该技术不仅能有效检测出小RNA，而且还能简便、快速、安全以及准确的进行定量分析待测非编码小RNA。本专利技术提供的检测非编码小RNA的方法，步骤包括步骤1，在寡核苷酸探针的3’末端标记非同位素；步骤2，将已标记非同位素的探针与样品RNA置于液体杂交环境中，使非编码小RNA和所述探针进行液相杂交形成杂化双链，分离所述杂化双链；步骤3，定量或定性检测所述小RNA。其中，所述定量或定性检测均可采用非变性聚丙烯酰胺凝胶系统进行检测，优选为15%非变性聚丙烯酰胺凝胶系统。本专利技术上述检测非编码小RNA方法中，步骤I中所述非同位素优选为生物素。使用所述生物素进行寡核苷酸探针标记的方法可以由本领域技术人员采用现有技术实施，如酶学法、化学法、光化学法等等。本专利技术上述的检测非编码小RNA方法中，分离得到所述杂化双链之后,加入HRP偶联酶亲和素使所述杂化双链显色，具体地，先将所述杂化双链转移至尼龙膜上，紫外线交联固定，然后加入所述HRP偶联链酶亲和素(以下也称为“链霉亲和素-HRP”)。本专利技术上述的检测非编码小RNA方法中，步骤I中所述寡核苷酸探针为待测小RNA的互补序列。本专利技术上述的检测非编码小RNA方法中，所述液体杂交环境包括杂交缓冲液，所述杂交缓冲液可以是磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。其中憐酸盐缓冲液组分30mmol/L phosphate buffer>0. 3mmol/L NaCl>lOmmol/LEDTA ；Tris-HCl 缓冲液组分100mM Tris-HCl( pH 值 8.5) 、500nM KCl、15mM MgCl2,l%Tritox-100，或者 IOOmM Tris-HCl (pH 值 7· 5)、IM NaClUOmM EDTA0本专利技术上述的检测非编码小RNA方法中，所述液相杂交可以采用PCR仪或水浴进行退火。其中，使用所述PCR仪退火方法为PCR仪上逐步降温，先90°C、2min，然后每90s降温1°C，直至温度将至25°C ;所述水浴退火条件为95°C水浴5min，然后置于42°C、2 3小时。本专利技术上述的检测非编码小RNA方法，可以用于定量检测小RNA含量，分析电泳检测杂化双链条带灰度值和未杂交探针条带灰度值，所述小RNA含量计算公式为杂化驭链条带灰度値权利要求1.一种检测非编码小RNA的方法，其特征在于，步骤包括步骤1，在寡核苷酸探针的3’末端标记非同位素；步骤2，将已标记非同位素的探针与样品RNA置于液体杂交环境中，使非编码小RNA和所述探针进行液相杂交形成杂化双链，分离所述杂化双链；步骤3，定量或定性检测所述小RNA。2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤2中所述液相杂交，采用PCR仪或水浴进行退火。3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述液体杂交环境包括杂交缓冲液，所述杂交缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述非同位素为生物素。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，分离所述杂化双链后，先将所述杂化双链转移至尼龙膜上，紫外线交联固定，加入所述HRP偶联链酶亲和素使所述杂化双链显色，然后进行步骤4。6.根据权利要求I所述的方法，步骤I中所述寡核苷酸探针为待测小RNA的互补序列。7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，定量检测所述小RNA方法为分析电泳检测杂化双链条带灰度值和未杂交探针条带灰度值，其中，使步骤2中所述探针足量，所述小RNA含量计算公式为8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述定量或定性检测采用非变性聚丙烯酰胺凝胶系统进行检测。9.一种如上述任意一项权利要求所述的方法在检测非编码小RNA中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述非编码小RNA为miRNA。全文摘要本专利技术提供了一种检测非编码小RNA的方法，寡核苷酸序列探针在末端转移酶作用下3’末端标记非同位素；将已标记探针和样品RNA置于液相杂交环境充分反应使样品中目的非编码小RNA和探针形成杂化双链。之后将杂交产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离结合为双链的RNA-探针和未杂交的过量探针，之后在转移至尼龙膜，经紫外线交联固定，加入链霉亲和素-HRP即可显色发光。在体系中，杂交后的目的RNA-探针与单一未杂交探针均能通过链霉亲和素-HRP，加入酶底物发出荧光条带，在X线光片显影。文档编号G01N27/447GK102952848SQ20111023525公开日2013年3月6日 申请日期2011年8月17日 优先权日2011年8月17日专利技术者高丰厚, 郭跃辉, 姜斌 申请人:上海交通大学医学院附属第三人民医院本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测非编码小RNA的方法，其特征在于，步骤包括：步骤1，在寡核苷酸探针的3’末端标记非同位素；步骤2，将已标记非同位素的探针与样品RNA置于液体杂交环境中，使非编码小RNA和所述探针进行液相杂交形成杂化双链，分离所述杂化双链；步骤3，定量或定性检测所述小RNA。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高丰厚，郭跃辉，姜斌，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第三人民医院，
类型：发明
国别省市：