本发明专利技术涉及用于制定大肠菌群定量曲线的标准样本的制备方法，该定量曲线的制作方法及其应用。首先取与待测的液体样本为同种产品的不含大肠菌群的样本，并调节pH值，制成无菌样本；再向无菌样本中加入大肠菌群标准菌株，并调节pH值，制得富菌样本，用无菌样本将富菌样本进行十倍递减稀释，制得标准样本。将标准样本进行培养，检测其pH值达到某一阈值时的检出时间。同时用平板法检测标准样本中的大肠菌群数。根据检出时间和平板法检测结果绘制大肠菌群定量曲线。取液体样本并调节pH值，制成待检测液，并用上述方法得到检出时间，再对照定量曲线得到液体样本的大肠菌群数。由于本方法平衡了样本之间的背景值，因此提高了检测的准确性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用于制定定量曲线的标准样本的制备方法，该定量曲线的制作方法及其应用，特别适用于 液体样本中大肠菌群的定量检测。
技术介绍
常规的大肠菌群计数方法主要包括大肠菌群Petrifilm 测试片法、国标GB4789. 3-2010《中华人民共和国国家标准食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》中提到的MPN计数法和平板计数法。这些检测方法耗时较长，工作量大，不利于大肠菌群的快速检测。目前，开发出许多利用大肠菌群生长过程中酸碱度变化快速检测大肠菌群含量的检测方法。如实时光电微生物快速检测系统，通过向培养中的样本加入酸碱指示剂、并利用比色法监测其PH值的变化，当pH值达到某一阈值时记录检出时间，由检出时间对照定量曲线判断样品中大肠菌群含量。实时光电微生物快速检测系统易操作且耗时较短，仅需6-10小时就可得出检测结果，其中，定量曲线的制作是准确定量的关键所在。定量曲线制作过程中用到标准样本，用目前的方法制备的标准样本都存在样本背景不一致的问题，影响定量曲线的准确性，在最终用于大肠菌群含量的检测时造成不必要的误差。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供用于制定大肠菌群定量曲线的标准样本的制备方法，使得制备得到的标准样本之间的背景值一致。本专利技术的又一目的是提供制作大肠菌群定量曲线的方法，其中标准样本的制备方法使得制备得到的标准样本的背景值一致，可提高大肠菌群定量曲线的准确性。本专利技术的另一个目的是提供大肠菌群定量曲线在检测液体样本中大肠菌群含量中的应用，提高液体样本中大肠菌群含量检测的准确性。本专利技术提供了用于制定大肠菌群定量曲线的标准样本的制备方法，包括以下步骤取不含大肠菌群的样本，调节pH至6. 7±0. 2，制成无菌样本。向每毫升无菌样本中加入彡IO4CFU且彡IOltlCFU的活化的大肠菌群标准菌株，并调节pH至6. 7±0. 2，获得富菌样本；将富菌样本用无菌样本进行十倍递减稀释，待稀释后的富菌样本的理论大肠菌群浓度值< 10CFU/毫升时，停止稀释，制成富菌样本的十倍递减系列稀释液，即为标准样本。本专利技术还提供了大肠菌群定量曲线的制作方法，包括以下步骤根据上述的标准样本的制备方法制备标准样本，标准样本的样本总数> 50个；分别将标准样本按相同的体积比接种到大肠菌群选择培养基中进行培养，并监测接种了标准样本的选择培养基的PH值的变化，待PH值达到设定阈值时，记录标准样本的检出时间；分别利用大肠菌群平板计数法对标准样本中的大肠菌群进行计数，得出每毫升标准样本中大肠菌群数；根据标准样本的检出时间和每毫升标准样本中大肠菌群数的常用对数值绘制大肠菌群定量曲线。本专利技术又提供了如上所述大肠菌群定量曲线在检测液体样本中大肠菌群含量中的应用，包括以下步骤取与无菌样本为同种产品的液体样本，调节PH至6. 7±0. 2，制成液体样本的待检测液；将待检测液按上述体积比接种到大肠菌群选择培养基中进行培养，并监测接种了待检测液的选择培养基的PH值的变化，待pH值达到上述设定阈值时，记录待检测液的检出时间；用待检测液的检出时间对照大肠菌群定量曲线，得出每毫升待检测液中大肠菌群数的 常用对数值，并计算每毫升液体样本中的大肠菌群数。在大肠菌群定量曲线在检测液体样本中大肠菌群含量中的应用的一种示意性实施方式中，接种时的体积比为1:1。在大肠菌群定量曲线在检测液体样本中大肠菌群含量中的应用的一种示意性实施方式中，培养的温度为35±1°C。在大肠菌群定量曲线在检测液体样本中大肠菌群含量中的应用的一种示意性实施方式中，通过比色法监测pH值的变化。在大肠菌群定量曲线在检测液体样本中大肠菌群含量中的应用的一种示意性实施方式中，PH值的设定阈值为5.8。本专利技术的标准样本制备方法中，通过制备具有相同背景的无菌样本和富菌样本，并将富菌样本用无菌样本进行稀释，制成富菌样本的十倍递减系列稀释液，制成标准样本，使得标准样本的背景值一致。本专利技术的制作大肠菌群定量曲线的方法中，利用前述标准样本制备方法制备标准样本，使得制作的大肠菌群定量曲线能更准确地反映检出时间与实际菌落量之间的线性关系，提高了大肠菌群定量检测时的准确性。本专利技术的大肠菌群定量曲线在检测液体样本中大肠菌群含量中的应用，使用与液体样本为同种产品的无菌样本、通过特定的方法制定大肠菌群定量曲线，用于液体样本中大肠菌群含量的检测，使得检测结果更为准确。附图说明以下附图仅对本专利技术做示意性说明和解释，并不限定本专利技术的范围。图I是本专利技术实施例3生成的用于检测冰淇淋中大肠菌群的大肠菌群定量曲线。图2是本专利技术实施例4生成的用于检测低温酸奶中大肠菌群的大肠菌群定量曲线。具体实施例方式为了对专利技术的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图说明本专利技术的具体实施方式。实施例I : 一种标准样本制备方法。I、溶液试剂。活化的大肠菌群标准菌株取肺炎克雷伯菌标准菌株(ATCC13882)，接种于灭菌的营养肉汤中，于36. 5± 1°C恒温振荡培养箱中培养18-24小时,计数后备用。2、操作步骤。I)取不含大肠菌群的融化冰淇淋，调节pH至6. 7±0. 2，制成无菌样本。为了检测的方便，可根据样本的浓稠度，用灭菌的生理盐水对不含大肠菌群的融化冰淇淋进行一定比例的稀释，再调节pH至6. 7 ± O. 2，制成无菌样本。2)取9份无菌样本分别加入如下表所示一定量的活化的大肠菌群标准菌株，并调节pH至6. 7 ± O. 2，获得9份富菌样本。样本编号标准菌株的力口入量(CFU/晕升)_ 富菌样本I 5. OXlO4 富菌样本2 5. OXlO9 富菌样本3 I. IXlO5 富菌样本4 9. 5 X IO8 富菌样本5 I. 5 X IO9· 富菌样本6 I. 5 X IO9 富菌样本7 7. IXlO8 富菌样本8 8. 2 X IO4 富菌样本9 |2. OXlO93)将9份富菌样本分别用无菌样本进行十倍递减稀释，待稀释后的富菌样本的理论大肠菌群浓度值< 10CFU/毫升时，停止稀释，制成9份富菌样本的十倍递减系列稀释液，为9组标准样本。例如，富菌样本8中标准菌株的加入量为8. 2X IO4 CFU/毫升，对其进行十倍递减稀释得到的理论大肠菌群浓度值应该分别为稀释倍数为10时的理论大肠菌群浓度值为8. 2 X IO3CFU/毫升；稀释倍数为IO2时的理论大肠菌群浓度值为8. 2 X IO2 CFU/毫升、稀释倍数为IO3时的理论大肠菌群浓度值为8. 2 X IO1CFU/毫升；稀释倍数为IO4时的理论大肠菌群浓度值为8. 2 CFU/毫升。其中，当稀释倍数为IO4时的理论大肠菌群浓度值为8.2 CFU/毫升，小于10CFU/毫升，所以，当对富均样本8的稀释达到IO4倍时，停止稀释。实施例2 :另一种标准样本制备方法。I、溶液试剂。活化的大肠菌群标准菌株取弗氏柠檬酸杆菌标准菌株(ATCC43864)，接种于灭菌的营养肉汤中，于36. 5± 1°C恒温振荡培养箱中培养18-24小时,计数后备用。2、操作步骤。I)取不含大肠菌群的低温酸奶,调节pH至6. 7±0. 2,制成无菌样本。为了检测的方便，可根据样本的浓稠度，用灭菌的生理盐水对不含大肠菌群的低温酸奶进行一定比例的稀释，再调节p本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于制定大肠菌群定量曲线的标准样本的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 取不含大肠菌群的样本，调节pH至6.7±0.2，制成无菌样本； 向每毫升所述无菌样本中加入≥104CFU且≤1010CFU的活化的大肠菌群标准菌株，并调节pH至6.7±0.2，获得富菌样本；和 将所述富菌样本用所述无菌样本进行十倍递减稀释，待稀释后的所述富菌样本的理论大肠菌群浓度值≤10CFU/毫升时，停止所述稀释，制成所述富菌样本的十倍递减系列稀释液，即为标准样本。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓川，薛志清，杜丽，喻东威，赵源，刘志楠，李梅，刘卫星，
申请(专利权)人：内蒙古蒙牛乳业集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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