本发明专利技术公开了一种消除克雷伯氏肺炎杆菌合成2，3-丁二醇和乙偶姻能力的方法，该方法通过对克雷伯氏肺炎杆菌2，3-丁二醇合成途径中乙酰乳酸脱羧酶基因进行失活，从而阻断乙酰乳酸转化成乙偶姻的催化反应。利用本发明专利技术，在克雷伯氏肺炎杆菌利用甘油合成1，3-丙二醇时，消除了副产物2，3-丁二醇和乙偶姻的合成，提高了甘油向1，3-丙二醇的转化率。
【技术实现步骤摘要】
,3-丁二醇和乙偶姻能力的方法
本专利技术涉及一种克雷伯氏肺炎杆菌的消除代谢副产物的方法，特别是涉及一种，3-丁二醇和乙偶姻能力的方法。
技术介绍
克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)是一种革兰氏阴性细菌,在分类学上与大肠杆菌属于同一个属。克雷伯氏肺炎杆菌代谢甘油可以生成1，3_丙二醇，并具有较高的生产强度和转化率，相关研究受到很大的关注。克雷伯氏肺炎杆菌在利用甘油合成1，3-丙二醇的同时还合成2，3- 丁二醇、乙偶姻(3-羟基-2- 丁酮)、乙醇、琥珀酸、乙酸和乳酸等副产物，这些副产物的合成消耗大量的底物，同时给 1，3_丙二醇的分离提取带来沉重的负担。目前，已经有一些工作通过敲除副产物的合成途径来消除或降低这些副产物的产生。Xu等在克雷伯氏肺炎杆菌HR526中敲除了乳酸脱氢酶基因，从而降低了菌株合成乳酸的能力，同时该菌株利用甘油生产1，3_丙二醇的底物转化率和产物终浓度都得到了提高。Zhang 等在克雷伯氏肺炎杆菌 YMU2 中敲除了乙醛脱氢酶，阻断了乙醇的合成途径，从而降低了菌株合成乙醇的能力，同样利用该菌株转化甘油生成 I，3_ 丙二醇的能力提高。在所有这些副产物中，2，3-丁二醇的合成量较大，并且化学性质与I，3-丙二醇接近，与1，3_丙二醇的分离成本较高。在克雷伯氏肺炎杆菌中2，3_ 丁二醇由中心代谢产物丙酮酸开始，两分子丙酮酸经过乙酰乳酸合成酶催化合成乙酰乳酸，乙酰乳酸脱羧酶催化乙酰乳酸脱羧形成乙偶姻，乙偶姻在乙偶姻氧化还原酶的催化下还原形成2，3-丁二醇。菌株在合成2，3_ 丁二醇的同时其前体物质乙偶姻也有一定的积累。但是目前并未见消除雷伯氏肺炎杆菌这两种物质合成能力的研究报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种，3_ 丁二醇和乙偶姻能力的方法。通过本专利技术的方法，在克雷伯氏肺炎杆菌利用甘油合成1，3_丙二醇过程中，可以消除2，3_ 丁二醇和乙偶姻这些副产物，减少1，3-丙二醇分离提取步骤，同时提高底物转化率。为解决上述技术问题，本专利技术的，3_ 丁二醇和乙偶姻能力的方法，是通过对克雷伯氏肺炎杆菌2，3- 丁二醇合成途径中乙酰乳酸脱羧酶基因进行失活，从而阻断乙酰乳酸转化成乙偶姻的催化反应，实现克雷伯氏肺炎杆菌合成2，3- 丁二醇和乙偶姻能力的消除。上述方法的具体步骤，包括I)利用PCR扩增克雷伯氏肺炎杆菌乙酰乳酸脱羧酶基因，通过TA克隆方法连接到克隆载体，并进行序列测定；2)利用步骤I)克隆到的基因序列，制备两侧连有乙酰乳酸脱羧酶基因的同源臂、中间连接抗性核的DNA片段；3)利用转化或接合方法，将步骤2)制备的DNA片段转 入到克雷伯氏肺炎杆菌中，利用同源重组与克雷伯氏肺炎杆菌染色体上的乙酰乳酸脱羧酶基因进行重组，筛选获得乙酰乳酸脱羧酶基因失活的菌株。所述步骤I)中，PCR扩增中的上游引物为SEQ ID NO. I所示，下游引物为SEQ IDNO. 2所示；克隆载体,包括质粒。所述步骤2)中，乙酰乳酸脱羧酶基因的同源臂制备中的同源序列PCR扩增上游引物为SEQ ID NO. 6所示，下游引物为SEQ ID NO. 7所示；抗性核包括链霉素、安谱霉素、氯霉素、壮观霉素和四环素等抗性基因。所述步骤1)-3)中，乙酰乳酸脱羧酶是菌体中催化乙酰乳酸脱羧形成乙偶姻的酶，酶国际系统分类编号EC 4. I. I. 5,在克雷伯氏肺炎杆菌中一般由259个氨基酸残基构成。筛选获得乙酰乳酸脱羧酶基因失活的菌株中，先筛选得到具有抗性核的菌株，并以SEQ IDN0. I和SEQ ID NO. 8所示的引物进行PCR扩增验证。本专利技术通过对乙酰乳酸脱羧酶基因进行失活，在克雷伯氏肺炎杆菌利用甘油合成1，3_丙二醇时，能消除2，3_丁二醇和乙偶姻这些副产物的产生，减少了 1，3_丙二醇分离提取步骤，同时，提高甘油(底物)向I，3-丙二醇的转化率。具体实施例方式以下实施例中使用的质粒、PCR试剂等采用商业产品，具体操作按照说明书进行。其他未注明的实验操作按照常规分子操作方法进行。实施例I消除克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1. 6366合成2，3_ 丁二醇和乙偶姻能力的方法本实施例中的CGMCC1. 6366菌株为中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，具有氨苄青霉素抗性。本实施例的消除克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1. 6366合成2，3_ 丁二醇和乙偶姻能力的方法，其具体步骤如下I、利用PCR扩增克雷伯氏肺炎杆菌乙酰乳酸脱羧酶基因(budA)，通过TA克隆方法连接到克隆载体，并进行DNA序列测定。根据克雷伯氏肺炎杆菌MGH78578 (Genbank CP000647)基因组信息，设计乙酰乳酸脱羧酶 PCR 引物，上游引物 budA-s GAAGATCAGAACATCGCCAGA (SEQ ID NO. I 所示)，下游引物 budA-a CTCTGATGGACCTGCTTCGCCTTAT (SEQ I D NO. 2 所示)。通过上述引物，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1. 6366基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得乙酰乳酸脱羧酶基因片段，通过TA克隆方法(Original TA Cloning Kit)连接到pMD-18T simple质粒上,命名为pMD18T-budA质粒,序列测定结果如下 budA基因相邻上游部分序列为GAAGATCAGAACATCGCCAGAAAGCGTTTCACCGTGCGCGAGCGCTCGAAGCGCCGCCAGGCGATGGCGATATCGGTCTTCAGCGGTGCCCCGCTGAGCGGGTGATAGCTGACGTTCGGCTGTTGAATGCAGGTCATCGACTGCGGGACCAGCGCGAAGCCGAACCCGGCATTGACCATGCTCAGCGATGACGAAATCTGCGACGACTGCCAGGCGCGCTCCATATCGATGCCGGCGCGCAGGCAGCTGTTGTACACCAGCTCATACAGCCCCGGGGCCACCTCCCGCGGGA(SEQ IDNO. 3所示)οbudA基因阅读框为AGAGAGTCTGTGCGAAACCCTGCGGGCGTTTTCCGCGCAGCATCCCGAGAGCGTGCTCTATCAGACATCGCTCATGAGCGCCCTGCTGAGCGGGGTTTACGAAGGCAGCACCACCATCGCGGACCTGCTGAAGCACGGCGATTTCGGTCTCGGCACCTTTAATGAGCTGGACGGGGAGCTGATCGCCTTCAGCAGTCAGGTCTATCAGCTGCGGGCCGACGGCAGCGCGCGCAAAGCCCAGCCGGATCAGAAAACGCCGTTCGCGGTGATGACCTGGTTCCAGCCGCAGTACCGGAAAACCTTCGACCATCCGGTGAGCCGCCAGCAGCTGCACGAGGTGATCGACCAGCAAATCCCCTCTGACAACCTGTTCTGCGCCCTGCGCATCGACGGCCATTTCCGCCATGCCCATACCCGCACCGTGCCGCGCCAGACGCCGCCGTACCGGGCGATGACCGACGTCCTCGACGATCAGC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种消除克雷伯氏肺炎杆菌合成2，3?丁二醇和乙偶姻能力的方法，其特征在于：通过对克雷伯氏肺炎杆菌2，3?丁二醇合成途径中乙酰乳酸脱羧酶基因进行失活，阻断乙酰乳酸转化成乙偶姻的催化反应，消除克雷伯氏肺炎杆菌合成2，3?丁二醇和乙偶姻能力。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郝健，魏东，史吉平，姜标，
申请(专利权)人：上海中科高等研究院，
类型：发明
国别省市：
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