一种让慢性粒细胞白血病细胞凋亡的系统及其方法技术方案

本发明专利技术为一种让慢性粒细胞白血病细胞凋亡的系统，由载入腺病毒的两个融合肽N3R、两个化合物AP21967和载入腺病毒的融合肽F2S连接在一起构成。本发明专利技术系统和方法通过实验验证，可以达到和实现诱导CML细胞凋亡，并且效果非常好，对于治疗白血病的研究及药物的开发具有很大的研究价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学基础研究領域，具体的说，涉及一种导致白血病细胞凋亡的系统及其方法。
技术介绍
慢性粒细胞白血病(CML)是ー种发生在早期多能造血干细胞上的恶性骨髓增生性疾病。主要涉及髓系，临床表现为脾肿大、外周血中粒细胞显著增多并出现幼稚粒细胞。在受累的细胞系中，可找到Ph染色体和(或)bcr-abl融合基因。bcr-abl融合基因编码的Bcr-Abl融合蛋白具有组成性激活的酪氨酸激酶活性，通过激活PI3K、STAT5等抗凋亡信号显著地抑制细胞凋亡，诱导细胞的转化，从而引起CML的发生发展。目前临床应用于CML治疗的ー线药物是imatinib，它通过竞争性结合Bcr-Abl蛋白中的ATP结合位点，使Bcr-Abl 不能磷酸化底物从而阻断CML进展。但是，目前临床上仍有1/3的患者对imatinib不耐受或者耐药，对于这些患者需要寻求另外的替代疗法。
技术实现思路
为解决以上技术问题，本专利技术的目的在于提供ー种让慢性粒细胞白血病细胞凋亡的系统及其方法。本专利技术目的是这样实现的RATS靶向Bcr-Abl入核借酪氨酸激酶活性诱导CML细胞凋亡的立项依据如下I. Bcr-AbI与c_AbI之间显示出明显的细胞内定位和效应的差异，在CML发病中起着重要作用Bcr-Abl和c_Abl都含有相同的与蛋白定位相关的核定位信号(nuclearlocalization signal, NLS)和核输出信号(nuclear export signal, NES),但 c_Abl 在细胞浆和细胞核都可定位，而Bcr-Abl则只定位于细胞浆。位于核内的c-Abl是ー个重要的凋亡诱导蛋白，它活化后通过磷酸化转录因子P73使其转录活性增强，激活caspase凋亡信号途径，诱导细胞的凋亡；位于胞浆的Bcr-Abl则通过激活抗凋亡信号显著地抑制细胞凋亡，诱导细胞的转化。2.将Bcr-Abl转运到核内，并利用Bcr-Abl的激酶活性，磷酸化p73，激活凋亡信号，从而诱导CML细胞凋亡思路的依据在DNA损伤吋，c-Abl入核并被激活，是DNA损伤应激诱导细胞凋亡所必需的，当缺失c-Abl或c-Abl的激酶活性时细胞就对凋亡诱导不敏感。因此，c-Abl入核和激酶活性被激活是DNA损伤时c-Abl激活凋亡信号的前提。Bcr-Abl在结构上具有和c-Abl —样的效应结构域,更重要的是Bcr-Abl的激酶活性在细胞内是组成性激活的，因此，Bcr-Abl进入核内就可以通过其激酶活性磷酸化P73，诱导细胞凋亡。3.将CML细胞的Bcr-Abl转运到核内的策略①核定位信号(NLS)在蛋白由胞浆向胞核内转运中的作用真核细胞内的蛋白由胞浆向胞核内转运需要通过细胞核和细胞浆间屏障核膜的核孔复合物，这个过程是由核定 位信号(NLS)的引导发生的。②雷帕霉素类似物转运系统(rapamycinanalog transport system, RATS):雷帕 霉素(Rapamycin)是一种天然的小分子化合物,它在细胞内和FKBP蛋白(FK506_binding protein, FKBP)结合形成雷帕霉素-FKBP 二元复合物后,对雷帕霉素祀(mammalian traget of rapamycin,mTOR)的FRB结构域(FKBP-rapamycin binding domain,FRB)具有很高的亲 和性和特异性，形成FRB-雷帕霉素-FKBP三元复合物，从而选择性诱导了 FRB和FKBP的相 互作用。因此，如果将核定位信号与FRB融合，在雷帕霉素诱导的蛋白相互作用下，定位信 号被传递给FKBP，或是与FKBP融合的目标蛋白，通过这种方式，就可以实现蛋白的转运。为 了避免雷帕霉素对正常细胞的影响，可用雷帕霉素类似物(rapamycin analog)即AP21967 来代替雷帕霉素，同时对FRB进行突变修饰，这样AP21967就只结合突变修饰的FRB，而不结 合细胞内的雷帕霉素靶的FRB。综上所述，雷帕霉素类似物AP21967和FKBP、FRB以及与之 融合的核定位信号也就组成了雷帕霉素类似物核转运系统(rapamycin analog transport system, RATS),通过RATS实现的蛋白核转运也在越来越多的研究中得到了应用。③RATS 如何实现对 Bcr-Abl 的靶向转运Grb2 的 SH2 (Src homology 2，SH2)结 构域和Bcr-Abl的Y177特异性结合，在AP21967诱导FRB和FKBP相互作用时，就可以将与 FRB融合的核定位信号传递给与FKBP融合的SH2，进一步传递给Bcr-Abl，从而将Bcr-Abl 转运入核。④外源性FKBP-SH2和NLS-FRB融合肽如何进入靶细胞转运Bcr-Abl入核从而 激活P73 :选用Ad5腺病毒载体作为表达载体，分别构建表达FKBP-SH2和带有核定位信号 的NLS-FRB融合肽，将腺病毒同时感染CML细胞，加入AP21967后，RATS靶向转运Bcr-Abl 入核，既可以减少胞浆中的Bcr-Abl蛋白水平及其介导的致白血病信号，又可以使入核的 Bcr-Abl发挥其激酶活性，磷酸化p73，激活凋亡信号，达到诱导CML细胞凋亡的目的。根据以上依据进行了实际的操作，发现效果明显。实验验证专利技术效果中，为了检测的方便，在N3R前端加上一段氨基酸序列FLAG标 签构成FN3R，FLAG标签具体为DYKDDDDK ;在F2S前端加上一段氨基酸序列HA标签构成 HF2S, HA 标签具体为YPYDVPDYAVD。I.重组腺病毒Ad5-FN3R、Ad5_HF2S的构建与鉴定FN3R片段通过重叠PCR扩增获得，通过分子克隆方法将FN3R片段插入腺 病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV，经菌落PCR筛选、双酶切及测序鉴定，证实构建的质粒 pAdTrack-CMV-FN3R与预期的序列相符。采用分步克隆的方法，将HA，两段FKBP及SH2依次 插入pAdTrack-CMV中，构建含HF2S片段的质粒。经菌落PCR筛选、双酶切及测序鉴定，证 实构建的质粒pAdTrack-CMV-HF2S与预期的序列相符。同样的方法构建含突变片段HF2Sm 的质粒。将穿梭质粒与腺病毒的骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌中重组，经琼脂糖凝胶 电泳、Pac I酶切鉴定，筛选出正确重组的腺病毒载体Ad5-FN3R、Ad5-HF2S、Ad5-HF2Sm。将 腺病毒载体Ad5-FN3R、Ad5-HF2S、Ad5-HF2Sm线性化后转染AD-293细胞，在AD-293细胞中 进行腺病毒的包装、扩增，获得高滴度的腺病毒Ad5-FN3R、Ad5-HF2S、Ad5_HF2Sm。2. PCR 及 western blot 鉴定 FN3R、HF2S 及 HF2Sm 在细胞中的表达腺病毒溶液经蛋白酶K处理后，作为模板进行PCR扩增，各病毒均扩增得目的条带(图I中A，B)。而以Ad5空载为模板的阴性对照没有条带。重组腺病毒感染AD-293细胞和K562细胞后，提取总蛋白，Western blot检测到目的蛋白在两种细胞中的表达，而Ad5空载对照组未检测到表达(图I中C，D)。图I 中 A. PCR 鉴定 FN3R 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种让慢性粒细胞白血病细胞凋亡的系统，其特征在于：由载入腺病毒的两个融合肽N3R、两个化合物AP21967和载入腺病毒的融合肽F2S连接在一起构成；所述融合肽N3R为3段NLS和FRB连接组成，所述融合肽F2S为2段FKBP和SH2连接组成，一段FKBP通过一个化合物AP21967与一段FRB结合；一个融合肽F2S通过化合物AP21967同时结合两个融合肽N3R；所述融合肽N3R的氨基酸序列为：PKKKRKVPKKKRKVPKKKRKVELIRVAILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISKQ；所述融合肽N3R的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示；所述融合肽F2S的氨基酸序列为：MGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEAAAMGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGTLEWFFGKIPRAKAEEMLSKQRHDGAFLIRESESAPGDFSLSVKFGNDVQHFKVLRDGAGKYFLWVVKFNSLNELVDYHRSTSVSRNQQIFLRDIE；所述融合肽F2S的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：冯文莉，黄峥兰，高淼，罗红伟，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：