质粒型载体、基因启动子活性的检测方法、及分析试剂盒技术

质粒型载体、基因启动子活性的检测方法、及分析试剂盒本发明专利技术的课题是以高灵敏度检测基因启动子的活性。本实施方式中涉及的质粒型载体含：基因启动子、第1基因、第2基因、内部核糖体结合序列、转录终止信号序列、及复制起始序列。第1基因编码配置在基因启动子之下游的，用于可视化基因启动子的活性的报告子蛋白质。第2基因编码配置在基因启动子之下游的复制起始蛋白质。内部核糖体结合序列配置在第1基因和第2基因之间。转录终止信号序列编码用于终止第1基因和第2基因的转录的信号。复制起始序列被复制起始蛋白质识别。

【技术实现步骤摘要】
质粒型载体、基因启动子活性的检测方法、及分析试剂盒相关申请的交叉引用本申请基于2011年8月25日提交的在先日本专利申请No. 2011-183896，并要求其优先权，其全部内容通过弓I用并入本文。
本实施方式涉及质粒型载体、基因启动子活性的检测方法、及分析试剂盒。
技术介绍
人基因组的碱基序列被确定以来，以基因组信息作为基础的疾病的新的诊断法的开发被期待。例如，由基于基因组的碱基序列信息的基因解析，发现了以癌为首的多种疾病关联基因。这些的疾病关联基因或疾病关联蛋白质作为癌等的疾病的诊断用生物标记物(bio-marker)而被关注。但是，由生物标记物检测的诊断由于在疾病的早期得不到必然充分的生物标记物的表达等的原因，得不到稳定的结果是现状。疾病的早期诊断，即便从治愈率的升高或患者的负担轻减的方面来看，也对今后的医疗不可或缺。作为早期诊断的一种方法，可举出检测在疾病的早期表达的基因的启动子活性的变化的方法。通过基因启动子的活性变化，基因的表达概率被控制。基因启动子的活性相比疾病关联基因或疾病关联蛋白质的表达更早期被观察到。作为检测细胞内的基因启动子的活性的方法，可举出报告子基因分析(reportergene assay)。报告子基因分析是将连结用于可视化启动子的活性的报告子基因的表达盒整合到所述启动子之下游的报告子载体导入被检细胞而基于报告子蛋白质的活性定量化所述启动子的活性的方法。作为报告子基因，采用萤光素酶基因或半乳糖苷酶基因、荧光蛋白质基因等。但是，例如，在疾病早期，基因启动子的活性变化而处于前疾病化的状态的细胞是极其少数。为诊断采集的血液或组织中含所述细胞的概率说不上高。因此，需求在疾病的早期诊断等，高灵敏度的检测技术。现在，作为高灵敏度的报告子基因分析，报告了由基因启动子和荧光蛋白质整合到病毒(virus)的基因组的病毒型报告子载体的方法。在此报告子基因分析中，通过在感染病毒载体的宿主细胞之内部增殖所述病毒载体，增加荧光蛋白质的表达量，使报告子基因分析高灵敏度化。但是，病毒型报告子载体在向宿主细胞的所述载体的导入中利用病毒的感染能力。因此，有病毒型报告子载体感染操作者的危险性。从而，病毒型报告子载体的操作不简便，安全性成为课题。另一方面，质粒型报告子载体相比病毒型报告子载体更操作简便，并且也不具有感染性而安全性高。使用质粒型报告子载体的报告子基因分析也有很多报告。期待向疾病的早期诊断的质粒型报告子载体的适用。但是，质粒型载体与病毒型报告子载体不同，在宿主细胞之内部不增殖，因此其检测灵敏度有问题。现有技术文献非专利文献lKojimaT.、JCL、2009 年、第 119 卷、p3172_8
技术实现思路
专利技术要解决的技术课题实施方式的目的是提供可以高灵敏度检测基因启动子的活性的质粒型载体、基因启动子的检测方法、及分析试剂盒。解决课题的技术方案本实施方式中涉及的质粒型载体具备基因启动子；以及第I基因，其编码配置在上述基因启动子之下游的，用于可视化上述基因启动子的活性的报告子蛋白质；以及第2基因，其编码配置在上述基因启动子之下游的复制起始蛋白质；以及内部核糖体结合序列，其配置在上述第I基因和上述第2基因之间；以及转录终止信号序列，其编码用于终止上述第I基因和上述第2基因的转录的信号；以及复制起始序列，其被上述复制起始蛋白质识·别。专利技术效果以高灵敏度检测基因启动子的活性。附图说明图I是示本实施方式中涉及的质粒型载体的结构的模式图。图2是示使用图I的质粒型载体的，基因启动子活性的检测方法(报告子基因分析)的全过程的图。图3是示本实施方式中涉及的质粒型载体pCMV-Luc-IRES-LT的制备方法的典型流程的模式图。图4A是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT的结构的模式图。图4B是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT-E107K的结构的模式图。图4C是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT-D402E的结构的模式图。图5是示本实施方式中涉及的阴性对照用的载体pCMV-Luc的制备方法的典型流程的模式图。图6是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV_Luc中的LT蛋白质的表达量的检测结果的图。图7A是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV_Luc的拷贝数的比较结果的图，是示pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV_Luc的溴化乙锭染色照片的图。图7B是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV_Luc的拷贝数的比较结果的图，是示用于pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV_Luc的拷贝数的比较的图。图8是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV_Luc的报告子蛋白质的发光信号的检测结果的图。图9是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV-Luc-IRES-LT-E107K和 pCMV-Luc-IRES-LT-D402E 的对pCMV-Luc 的报告子蛋白质的信号强度的比较结果的图。图10是示使用以往例中涉及的非扩增型的报告子载体的，基因启动子活性的检测方法的全过程的图。符号说明I···质粒型载体、10···基因启动子、21···报告子基因、23···内部核糖体结合序列(IRES)、25···复制起始蛋白质基因、27···转录终止信号序列、30···复制起始序列实施方式本实施方式中涉及的质粒型载体含基因启动子、第I基因、第2基因、内部核糖体结合序列、转录终止信号序列、及复制起始序列。第I基因编码配置在基因启动子之下游的，用于可视化基因启动子的活性的报告子蛋白质。第2基因编码配置在基因启动子之下 游的复制起始蛋白质。内部核糖体结合序列配置在第I基因和第2基因之间。转录终止信号序列编码用于终止第I基因和第2基因的转录的信号。复制起始序列被复制起始蛋白质识别。以下，参照附图说明本实施方式中涉及的质粒型载体、基因启动子的检测方法、及分析试剂盒。本实施方式中涉及的质粒型载体是通过检测对象的基因启动子在活化的宿主细胞中特异性地自身扩增来增强检测信号的质粒型的报告子载体。质粒型载体的结构图I是示作为本实施方式中涉及的自身扩增型报告子载体的质粒型载体I的结构的模式图。如图I所示，本实施方式中涉及的质粒型载体I有成为检测对象的基因启动子10。在成为检测对象的基因启动子10之下游，配置有用于转录及翻译的碱基序列20。碱基序列20含报告子基因21、内部核糖体结合序列(IRES :internal ribosome entry site)23、复制起始蛋白质基因25和转录终止信号序列27。在报告子基因21和复制起始蛋白质基因25之间配置有IRES23。复制起始蛋白质基因25之下游配置有转录终止信号序列27。另外，质粒型载体I在通过报告子基因21或复制起始蛋白质基因25的侧的基因启动子10和转录终止信号序列27之间以外的部位有复制起始序列30。再有，IRES23之上游配置有报告子基因21，下游配置有复制起始蛋白质基因25，但本实施方式不限于此。例如，在IRES23之上游配置有复制起始蛋白质基因25，本文档来自技高网...

【技术保护点】
质粒型载体，其具备：基因启动子、以及第1基因，其编码配置在上述基因启动子之下游的，用于可视化上述基因启动子的活性的报告子蛋白质、以及第2基因，其编码配置在上述基因启动子之下游的复制起始蛋白质、以及内部核糖体结合序列，其配置在上述第1基因和上述第2基因之间、以及转录终止信号序列，其编码用于终止上述第1基因和上述第2基因的转录的信号、以及复制起始序列，其被上述复制起始蛋白质识别。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：赤星英一，石原美津子，
申请(专利权)人：株式会社东芝，东芝医疗系统株式会社，
类型：发明
国别省市：