长爪沙鼠原代肝细胞的培养方法技术

本发明专利技术公开了一种长爪沙鼠原代肝细胞的培养方法，包括：（1）从消化成熟的离体长爪沙鼠肝脏中收集肝细胞初悬液，过滤，滤液除杂后加入含5%小牛血清的HBSS，反复离心洗涤，收集细胞沉淀于含20%新生牛血清的DMEM完全培养基中，调整肝细胞浓度为3.0×105个～5.0×105个/mL，制备成肝细胞悬液；（2）将肝细胞悬液接种于铺有鼠尾胶原的培养板中，于37℃、5%CO2环境中培养，4h后除杂，将培养基更换成含细胞因子的维持培养基，细胞贴壁过夜后，得到长爪沙鼠原代肝细胞。该方法价格低廉，经济实用，操作简便易行，获得的肝细胞贴壁牢、活力高，培养细胞的成活率高，稳定可靠，适于大规模生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种简便实用的。
技术介绍
我国长爪沙鼠的实验动物化研究始于1978年，目前我国主要有两个长爪沙鼠群，分别保存于浙江省实验动物中心和首都医科大学。长爪沙鼠对食物中的脂肪、维他命EJi固醇敏感，可作为研究食物源性胆固醇诱导的高胆固醇血症的动物模型。长爪沙鼠肝脏中低密度脂蛋白受体的表达与食物源蛋白显著相关，而人肝癌细胞的低密度脂蛋白受体表达则无显著变化，表明在研究细胞表面受体时原代肝细胞较瘤化的肝细胞系具有优势。值得注意的是长爪沙鼠的脂代谢与人类的脂代谢有诸多相似。长爪沙鼠血液中载脂蛋白与高密度脂蛋白胆固醇水平呈高度正相关，与人类代谢研究结果一致；低密度脂蛋白是脂蛋白胆固醇的主要载体，与人类相近；对红花油、橄榄油或椰子油的反应都与人相似。此外，长爪沙鼠是杂食性动物，由贫瘠的荒漠地带至实验室环境，饮食结构中脂质含量显著增加，与国民饮食结构改善类似。且长爪沙鼠个体小、易管理，因而是研究脂代谢的良好动物模型。肝脏在脂质代谢中起着重要作用，它能合成脂蛋白，有利于脂质运输，也是脂肪酸氧化和酮体形成的主要场所。肝脏主导胆固醇代谢，胆固醇在肝脏中合成，并可转变成胆汁酸盐随胆汁排出，同时肝脏还能将碳水化合物转变成脂肪。肝细胞是肝脏众多功能的最终承担者，肝细胞的体外培养成为很多体外实验研究的前提，治疗药物的研发、细胞周期的调控、激素与受体的相互作用等都广泛地应用离体肝细胞模型。原代肝细胞较好保留并维持了肝细胞形态的完整性和体外代谢活性，可以在接近生理浓度的情况下开展研究，并排除了其他器官、组织的影响。原代肝细胞培养已广泛应用于药物的体外代谢研究，它能在较短时间内得到大量的代谢产物，相对而言易于控制代谢条件、代谢体系单纯，在研究药物代谢途径、代谢机制和药物相互作用，尤其在代谢物结构鉴定方面具有较大的优越性。中国专利申请CN200910031021.9中公开了一种大鼠肝细胞分离培养的方法。大鼠用戊巴比妥钠麻醉，并给予肝素钠抗凝，做门静脉插管，两步灌流法灌流，取下消化成熟肝脏，收集肝细胞于4°C含1%牛血清白蛋白(BSA)的HANKS液中，肝细胞悬液用筛网过滤，滤液离心、沉淀后，收集沉淀于LEIBOVITZ’ S-15 (L-15)完全培养基中，调整肝细胞密度为3 6 X IO5个/mL接种于铺鼠尾胶原的培养板中，于37°C、5%C02环境中培养。接种后4h换液去除未贴壁及死细胞，继续培养20h后可用于试验。但该方法并不适用于长爪沙鼠肝细胞的培养。理想的肝细胞是该体外模型建立的前提，高产量、高活性、功能良好的肝细胞是其关键因素。目前国内尚无关于长爪沙鼠原代肝细胞离体模型的研究，国外也尚未建立完善的培养体系
技术实现思路
本专利技术旨在针对目前长爪沙鼠肝细胞培养方法的空缺，提供了一种简便实用的，为长爪沙鼠肝细胞应用于科学研究提供技术保障。—种，包括步骤( I)从消化成熟的离体长爪沙鼠肝脏中收集肝细胞初悬液，过滤，滤液除杂后加入含5%小牛血清的Hank' s平衡盐溶液(Hanks Balanced SaltSolutions,简称HBSS),反复离心洗涤，收集细胞沉淀于含20%新生牛血清的DMEM完全培养基中，调整肝细胞浓度为3.OX IO5个 5. OX IO5个/mL，制备成肝细胞悬液；(2)将肝细胞悬液接种于铺有鼠尾胶原的培养板中，于37°C、5%C02环境中培养，4h 后除去死亡及悬浮细胞，将培养基更换成含细胞因子的维持培养基，细胞贴壁过夜后，得到长爪沙鼠原代肝细胞。步骤(2)中，所述的含细胞因子的维持培养基为在DMEM基础培养基中加入10%新生牛血清、5 μ g/mL胰岛素、4 μ g/mL地塞米松、10ng/mL表皮细胞生长因子、5ng/mL肝细胞生长因子和2% 二甲基亚砜(DMS0);pH=7. 0-7. 4。含细胞因子的维持培养基的配制方法包括在DMEM基础培养基中加入新生牛血清、胰岛素、地塞米松、表皮细胞生长因子、肝细胞生长因子和DMS0，混合均匀，调节pH=7. 0-7. 4，制得含细胞因子的维持培养基，其中，新生牛血清的浓度为10%，胰岛素的浓度为5 μ g/mL，地塞米松的浓度为4 μ g/mL，表皮细胞生长因子的浓度为10ng/mL，肝细胞生长因子的浓度为5ng/mL，DMSO的浓度为2%。所述的含细胞因子的维持培养基的pH值优选为7. 0-7. 2，进一步优选为pH=7. 0，更利于长爪沙鼠原代肝细胞的成活。步骤(I)中，所述的过滤包括依次用100目和200目钢筛过滤。100目钢筛主要过滤肉眼可见的大的组织碎块，200目钢筛过滤微小碎块。如果直接用200目钢筛过滤，将导致大的组织碎块堵塞筛孔，使细胞得率大大降低、过滤耗时延长、增大了细胞受污染的可能性。步骤(I)中，所述的除杂包括18°C _28°C静置后过滤。步骤(I)中，所述的反复离心洗漆优选包括800rpm离心3min、600rpm离心3min、400rpm离心3min及400rpm离心3min,弃上清。rpm为转/分钟。步骤(I)中，调整肝细胞浓度优选为4. O X IO5个 5. O X IO5个/mL。所述的消化成熟的离体长爪沙鼠肝脏采用本领域现有方法得到，如胶原酶原位灌流法，一般可采用以下方法将长爪沙鼠用速眠新麻醉，同时注射肝素钠抗凝，用连接注射器的留置针行门静脉插管，首先用无钙灌流液开放灌流至肝脏呈土黄色或灰白色，接着用含钙的O. 025%胶原酶液开放灌流，2min后夹闭下腔静脉，继续灌注含钙胶原酶液至肝脏充盈，待肝脏消化成熟，柔软、压之留痕时开放下腔静脉，分离得到肝脏。本专利技术DMEM基础培养基，是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基。一般在DMEM基础培养基中添加血清、抗生素等中的一种或多种物质后，得到DMEM完全培养基。本专利技术所用的试剂和培养基等均采用市售产品，%除特别说明外，均指质量百分比。本专利技术方法得到的长爪沙鼠原代肝细胞变平变薄，核圆易见，逐渐呈岛屿状。相对于现有技术，本专利技术具有如下效果本专利技术的培养方法中，选用含20%新生牛血清的DMEM完全培养基制备肝细胞悬液，并辅助使用经过鼠尾胶原包被的培养板接种肝细胞，细胞贴壁效果更好，接种后4h即可形成单层紧密排列贴壁生长；选用含细胞因子的维持培养基对长爪沙鼠原代肝细胞进行贴壁培养，培养的肝细胞能够保留许多长爪沙鼠体内肝细胞的细胞功能和活性，可用于探索肝脏疾病机理、筛选防治药物等的研究。本专利技术的培养方法中，采用的试剂及培养基等均可市售得到，价格低廉，经济实用，操作简便易行，获得的肝细胞贴壁牢、活力高，培养细胞的成活率高，稳定可靠，适于大规模生产。附图说明图I为新分离的长爪沙鼠肝细胞200倍倒置 显微镜下观察图；图2为实施例I中培养24h后的长爪沙鼠肝细胞200倍倒置显微镜下观察图；图3为实施例I中培养48h后的长爪沙鼠肝细胞200倍倒置显微镜下观察图；图4为实施例I中培养72h后的长爪沙鼠肝细胞200倍倒置显微镜下观察图；图5为实施例I中长爪沙鼠肝细胞台盼蓝染色后200倍倒置显微镜下观察图；图6为新分离的长爪沙鼠肝细胞PAS染色后200倍倒置显微镜下观察图；图7为实施例I中培养24h后的长爪沙鼠肝细胞PAS染色后200倍倒置显微镜下观察图；图8为实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种长爪沙鼠原代肝细胞的培养方法，其特征在于，包括步骤：（1）从消化成熟的离体长爪沙鼠肝脏中收集肝细胞初悬液，过滤，滤液除杂后加入含5%小牛血清的Hank′s平衡盐溶液，反复离心洗涤，收集细胞沉淀于含20%新生牛血清的DMEM完全培养基中，调整肝细胞浓度为3.0×105个～5.0×105个/mL，制备成肝细胞悬液；（2）将肝细胞悬液接种于铺有鼠尾胶原的培养板中，于37℃、5%CO2环境中培养，4h后除去死亡及悬浮细胞，将培养基更换成含细胞因子的维持培养基，细胞贴壁过夜后，得到长爪沙鼠原代肝细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈立青，郭红刚，李长龙，卢领群，萨晓婴，戴方伟，宋晓明，
申请(专利权)人：浙江省医学科学院，
类型：发明
国别省市：