本发明专利技术涉及二硫键稳定的重组MHC?II类分子。特别地，本发明专利技术提供了一种重组MHC?II类分子，该重组MHC?II类分子包括：(i)MHC?II类分子α链细胞外部分的全部或部分；(ii)MHC?II类分子β链细胞外部分的全部或部分；其中，(i)和(ii)提供了功能性肽结合结构域，且其中(i)和(ii)通过位于所述α链α2结构域和所述β链的β2结构域中的半胱氨酸残基间的二硫键连接，其中，所述半胱氨酸残基不存在于天然MHC?II类的α2和β2结构域中。在原核系统中制备这些分子的方法以及这些分子的各种用途构成了另外的方面。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及二硫键稳定的重组MHC II类分子。
技术介绍
主要组织相容性复合体(MHC)分子为脊椎动物免疫系统的主要组成部分，存在于所有有核细胞表面。MHC有两种主要的形式，S卩MHC I类和MHCII类。重要的是，两种类型都与蛋白质水解加工的肽形成称为T细胞表位的功能性复合体，这发生于表达 特定MHC的完全相同的细胞中。产生的肽/MHC(pMHC)复合体随后作为跨膜复合体存在于细胞表面上一该现象称之为抗原递呈。然后细胞表面-结合的PMHC可以与其同源部分(cognatepartner)——T细胞受体(TCR)相互作用，所述T细胞受体存在于T淋巴细胞的表面。 鉴于其在适应性免疫中的重要作用，基础和应用科学对在细胞和分子水平上理解PMHC-TCR的相互作用很感兴趣，从而获得两种分子的重组类型。也日益认识到，能否获得这种重组分子对能研究和理解系统生物，以及对开发新的治疗和诊断是非常关键的。许多重大的医学疾病需要进行治疗干预(therapeutic interventions),以调节病人免疫系统的活动。在如自身免疫性疾病和过敏症中，需要抑制过于活跃的免疫系统和慢性炎症。相反，免疫刺激是与感染和癌症有关的途径，以将免疫细胞激活并靶向于癌细胞。此外，移植接受者通常需要免疫抑制。同时，这也导致了大量免疫调节剂的产生，目前是一个数十亿美元的产业。理解这些疾病中的免疫成分和筛选新的治疗方法的关键是抗原递呈细胞和T细胞间的相互作用，或者更具体地是MHC I型和II型分子与TCR间的相互作用。II型MHC特异性的与外源衍生肽结合，并将它们递呈给CD4+T辅助细胞(TH细胞)。然后所述TH细胞被活化并成为分泌各种细胞因子的效应细胞。这些细胞因子大量地活化参与处理威胁的其它免疫细胞。该系统的故障会导致诸如自身免疫性疾病或者使癌细胞生存和分裂。因此，自身免疫性疾病的特征是与MHC密切相关和靶器官T细胞浸润(infiltration)。用于免疫调节剂筛选的平台需要稳定的、完全功能性的可溶性MHCII类分子。重要的是，目前可溶MHC II类分子的制备由于严重的问题而受阻，即缺乏分子稳定性。在过去的几年里，制备四聚体的可溶MHC I类分子的能力(四聚体技术)已经使基础和应用免疫学发生了变革(Constantin et al. ,2002, Biological Research forNursing,4 :115-127)。原因是，无论是就抗原而目还是就T细胞反应而目，四聚体技术已大幅提高了以特定方式追踪免疫反应过程的能力，这主要通过流式细胞术来评估。这种能力也带来了对免疫系统更深入的了解且确实可能带来了新的诊断工具。到目前为止，四聚体试剂在很大程度上限于MHC I类分子，因为关于重组MHC I类制备的大多数技术问题似乎已经得到解决。事实上，就MHC II类分子而言，已经证明了这个任务更具显著的挑战性。因此，目前MHC II类四聚体制备的常规方法没有可用的，虽然在文献和商用试剂中都出现了独立的例子(Vollers, S. and Stern, L. , 2008, Immunology123 :305-313)。在MHC II类四聚体可获得的少量实例中，它们被广泛地使用，并已对了解疾病的发展产生了巨大的影响。因此，鉴于成功制备重组MHC I类产物已经显示的影响，可以看出无论在学术上还是商业上都存在强烈而清晰的动力，以在新的MHC II类生产道路中投入更多的努力。然而，鉴于迄今为止遇到的问题，成功是不确定的。由于部分不明的原因，已经证明了MHC II类分子制备成可溶形式的稳定重组分子尤其困难。天然分子是非共价的跨膜异质二聚体，包括α-和0-链，0-链和β_链都具有跨膜区且属于免疫球蛋白(Ig)超家族。各链的细胞外部分包括由两个结构域组成，每个结构域由大约90个氨基酸残基组成，其中两个膜远端结构域，α I和β I结构域形成对T细胞表位的肽结合性能所必需的格状的α / β结构(inter-latticed α / β structure)。两个膜近端结构域，α2和β 2结构域，均形成离散的Ig结构域。在α链和β链中，均有约20个氨基酸残基的一段跨越细胞膜且在膜的细胞质侧存在相当短的肽段。α链和β链的二聚作用被认为是由以下原因产生⑴跨膜片段，(ii)肽结合以及(iii)在膜中发现的推定的附属成分。因此，一旦脱离其天然环境并作为可溶性分子制备，MHC II类分子经常受到内在低稳定性和非常低的生产水平的制约。此外，必须进行广泛的和资源高要求情况依赖性的优化。·此外，鉴于二聚作用的上述要求，在任何非天然环境下的MHC II类分子制备的通用方法还不明朗，即在除与天然表达MHC II类分子的细胞的细胞膜相关制备以外的任何环境下，如其它生物实体、细胞或微粒(particles)表面上显示的非水溶性分子制备，如通过融合成病毒衣壳蛋白的方式在曬菌体表面表达的非水溶性分子。因此，目前还不存在可制备稳定MHC II类异二聚体的通用方法。然而，已进行了大量的研究，所有的研究都代表了特定案例成功的例子，这相当反映了任务的复杂性。这些例子是(i)真核细胞表面上的膜结合MHC II类异二聚体通过利用脂质系链(lipid tether)(GPI 锚定)的异位表达，参见 Wettstein et al.，1991，J. of Exp. Medicine, 174 :219-228 ；(ii)昆虫细胞中MHC II类胞外结构域(ectodomains)的表达，参见Wallny et al.,1995, Eur. J. Immunology, 25 :1262-1266 ； (iii)异源二聚作用基序的引入,如亮氨酸拉链、MHC II类分子C端的引入,结合昆虫细胞生产,参见Quarsten et al.,2001, J. Immunol.,167 :4861-4868 和 Crawford et al. ,2006, Immunological Reviews, 210 156-170 ； (iv)抗体/MHC II类嵌合体结合昆虫细胞生产的制备，参见Casares et al. , 1997, ProteinEngineering, 10 :1295-1301 ； (v)利用细菌表达系统使得功能性pMHC三聚体通过包涵体重折叠的方法而形成，参见 Arimilli et al.，1995，J. Biol. Chem.，270 =971-977 ;或者(vi)使用截断型细菌(truncated bacteral)产生的仅由al和β I结构域构成的单链MHCII类形式，使得功能性MHC分子通过包涵体重折叠的方法而形成,参见Burrows et al.,1999, Protein Engineering, 12 :771_778。此外，Landais et al. , 2009, J. Immunol. , 183 7949-7957描述了利用内部人工二硫桥与外源性亮氨酸拉链结合以制备稳定的小鼠I-AdOVA MHC II类四聚体的昆虫细胞表达系统。重要的是，尽管由于修饰，表达水平增加，显然这些稳定增加的分子没有表现出特异性T细胞染色。
技术实现思路
本文所描述的方本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.02.18 GB 1002730.8;2010.02.18 US 61/305728;201.一种重组MHC II类分子，其特征在于，该重组MHC II类分子包括 (i)MHCII类分子α链细胞外部分的全部或部分； (ii)MHCII类分子β链细胞外部分的全部或部分； 其中，⑴和(ii)提供了有功能性肽结合结构域，且其中⑴和(ii)通过位于所述α链的α 2结构域和所述β链的β 2结构域中的半胱氨酸残基间的二硫键连接，其中，所述半胱氨酸残基不存在于天然MHC II类的α2和β 2结构域中。2.根据权利要求I所述的重组MHCII类分子，其中，所述重组分子不包括亮氨酸拉链基序。3.根据权利要求I或2所述的重组MHCII类分子，其中，所述二硫键位于位置在小鼠I-E 亚类的 Pro 96a2-Ser 11902 (第 I 排)、Ser 95a2-Ser 12102 (第 2 排)或 Arg 94a2_Asn15102(第3排)的半胱氨酸残基或其它MHC II类亚类中的相应位置的半胱氨酸残基之间。4.根据权利要求3所述的重组MHCII类分子，其中，所述二硫键位于位置在小鼠I-E亚类的Ser 95a2-Ser 121@2(第2排)的半胱氨酸残基或其它MHC II类亚类中的相应位置的半胱氨酸残基之间。5.根据权利要求1-4中任意一项所述的重组MHCII类分子，其中，对应参考序列H-2EB*01(SEQ ID NO :2)位置38、42或106的半胱氨酸残基中的一个或多个，或者其它MHCII类亚类中相应位置处的半胱氨酸残基中的一个或多个被剔除。6.根据权利要求1-5中任意一项所述的重组MHCII类分子，其中，所述重组分子在丝状噬菌体的表面表达。7.根据权利要求6所述的重组MHCII类分子，其中，所述重组分子表达为与噬菌体表面蛋白 gpIII、gpVII、gpVIII 或 gpIX 的融合。8.根据权利要求7所述的重组MHCII类分子，其中，所述噬菌体表面蛋白为gpIX。9.根据权利要求1-5中任意一项所述的重组MHCII类分子，其中，所述分子为可溶性分子。10.根据权利要求9所述的重组MHCII类分子，其中，所述分子的(i)或(ii)与免疫球蛋白的Fe部分融合。11.根据权利要求1-10中任意一项所述的重组MHCII类分子，其中，所述分子为多聚...
【专利技术属性】
技术研发人员：吉尔·艾吉·洛塞特，泰耶·弗里格斯塔德，英格·桑德莱，比亚内·博根，
申请(专利权)人：奥斯陆大学，
类型：
国别省市：
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