本发明专利技术涉及一种哌嗪基嘧啶类同位素标记试剂的应用。所述的同位素标记试剂为轻质和重质的同位素标记试剂[d0]-/[d6]-2，4-二甲氧基-6-哌嗪基嘧啶。该试剂应用于脂肪酸、多肽或蛋白质等的含羧基化合物的比较分析中。1.脂肪酸的分析，包括下列步骤：a)脂肪酸分别与轻重标记试剂反应，后处理后进行LC-MS/MS分析，选取产物离子m/z?225和m/z?231作为定量离子。b)通过观察标记的脂肪酸的成对质谱峰即可对多种含羧基脂肪酸进行识别，根据其相对峰面积即可定量。2.多肽蛋白质比较分析，包括下列步骤：a)目标分析蛋白质等经过热变性、酶解后与前述的轻质或重质同位素标记试剂反应。b)将反应后的溶液进行后处理，进行MALDI-TOF?MS比较分析。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种哌嗪基嘧啶类同位素标记试剂的设计、合成方法，及其在含羧基化合物的质谱分析的应用。特别是结合液相色谱质谱和基质辅助激光解析质谱的方法，实现快速、高效、准确的质谱分析，为高通量的研究羧基化合物提供了良好的手段，更为诊断医学中生物标志物的质谱分析提供了一种策略。
技术介绍
诊断医学研究中的重要课题之一就是发现及监测人类疾病的新参数一生物标志物(biomarker)(参见J. Clin. Pharmacol. 2003, 43, 329.)。对于疾病研究，生物标志物一般是指可供客观测定和评价的一个普通生理或病理或治疗过程中的某种特征性的生化指标，通过对它的测定可以获知机体当前所处的生物学过程中的进程。检查一种疾病特异性的生物标志物，对于疾病的鉴定、早期诊断及预防、治疗过程中的监控可能起到帮助作用。寻找和发现有价值的生物标志物已经成为目前研究的一个重要热点。含羧基化合·物在制药工业，生物医学领域，包括体内代谢通路上都扮演了非常重要的角色(参见Anal.Chem. 1977，49，442.)，对于这些物质在生物标志物领域的研究正越来越多的被关注，且成为热点。脂肪酸类化合物如亚油酸、亚麻酸、EPA、DHA、花生四烯酸等作为一大类含羧基化合物是人体内和自然界中重要的代谢物，与多种代谢酶的功能相关。这些化合物的含量变化与人体内代谢紊乱有很大的关联，例如，肥胖，糖尿病、代谢紊乱综合症等多种疾病相关(参见 Biochem. J. 2011，435，723. Nature 2006，444 (7121)，840. Diabetes 2002, 51 (1), 7.Lipids Health Dis. 2011, 10, 82. Diabetes 2010, 1(3),68. )D 因此，对生物样本(如血浆，尿液)中脂肪酸类化合物进行定性和定量分析对研究许多生理变化和疾病诊断有非常重要的作用。以往多是采用先衍生化后气相色谱分析的方法，并按照峰面积归一化的方法进行定量分析该类物质。在商品化的试剂当中多是采用甲酯化和硅烷化等试剂，不仅标记试剂的反应活性较低而且准确性欠佳。此外，随着待测物分子量的增加，挥发性也逐渐下降，检测的灵敏度也不同程度的下降。所以，近年来逐渐有一些基于液相色谱质谱标记后分析该类化合物的报道(参见 Anal. Chem. 2007，79，5150. Anal. Chem. 2010，82，6790. Anal.Chem. 2011,83,3192.)，但这些试剂均有着其固有的缺点，例如标记时间较长，背景残留严重，标记选择性差(与羟基也反应)，灵敏度低，从而影响目标化合物的检测。而且这些试剂只能修饰一种类型的基团，能够适用的待测物有限，从而使其应用领域非常狭窄。这些局限性都促使了新的标记方法的发展和应用。此外，肽类和蛋白质类物质是人体内非常重要的含羧基的内源性生物活性物质，也是重要的生物标志物。它涉及激素、神经、细胞生长和生殖各领域，其重要性在于调节体内各个系统器官和细胞。其代谢水平与人体众多生理活动相关，检测这一类物质对于心脑血管等疾病的临床诊断具有重要意义，发展高灵敏度、高准确性的分析方法来检测肽类物质一直是科研工作者研究的热点和难点。在诊断医学研究中，许多肽类物质由于其微弱的含量以及较弱的质谱响应使得他们很难被定性定量检测到。如果能够将多肽和蛋白质中影响质谱正离子检测模式的羧基封闭，再标记上能够显著提高质谱信号的物质，则能够很好的提高该类大分子化合物的质谱响应，在未来的诊断医学研究中将发挥其巨大的潜力。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是提供一种哌嗪基嘧啶类同位素标记试剂的用途，用于上述试剂的脂肪酸等化合物和多肽蛋白质分析方法，尤其是用于质谱分析。本专利技术涉及到的这种同位素标记试剂化学名为-2，4_ 二甲氧基-6-哌嗪基嘧啶，(简写为-DMPP)，其结构如下权利要求1.一种哌嗪基嘧啶类同位素标记试剂的用途，哌嗪基嘧啶类同位素标记试剂具有如下结构式2.如权利要求I所述的用途，其特征是采用下述步骤 a)在乙醇或水溶液中，含羧基的有机化合物的目标分析物，无需任何分子转化直接与轻质的同位素标记试剂-2，4- 二甲氧基-6-哌嗪基嘧啶反应进行标记； b)对于小分子脂肪酸化合物，将标记后的样品经过或不经过强酸性阳离子树脂除杂，进行液相色谱质谱分析。3.如权利要求2所述的用途，其特征是所述的含羧基的有机化合物是脂肪酸、多肽或蛋白质。4.如权利要求2所述的用途，其特征是所述的步骤是在一对目标分析物乙醇、乙腈或水溶液中分别加入一对同位素标记试剂，即轻质的和重质的同位素标记试剂于室温下反应20秒，氮气吹干后，再用适量的含O. 1%三氟乙酸的50%乙腈水溶解，将标记后的样品经过或不经过强酸性阳离子树脂除杂进行液相色谱质谱分析或基质辅助激光解析MALDI质谱分析。5.如权利要求4所述的用途,其特征是所述的标记反应需加入30ηηιο1/μL的标记试剂8 μ L进行标记反应，且需要加入3 μ L的I-羟基-7-偶氮苯并三氮唑15nmol/ μ L催化剂和7 μ L的I-乙基-3- (3- 二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐15nmol/ μ L缩合剂，氮气吹干溶剂的方式结束标记反应。6.如权利要求5所述的用途，其特征是所述的目标分析物为脂肪酸化合物时，在70μL甲醇中分别与轻重标记试剂进行标记反应，标记后的样品经过强酸性阳离子树脂除杂，然后进行液相色谱质谱分析；目标分析物为多肽或蛋白质时，经过热变性、酶解后在70μ L乙腈溶液中分别与轻重标记试剂进行标记反应，标记后的样品不经过强酸性阳离子树脂除杂直接进行基质辅助激光解析MALDI质谱分析。7.如权利要求6所述的用途，其特征是所述的液相色谱质谱所用的条件是所有图谱的采集均是在正离子的模式下进行，流动相水或乙腈；碰撞气为氮气，碰撞能量为25-40eVo8.如权利要求6所述的用途，其特征是所述的液相色谱质谱分析，选取产物离子m/z225. I和m/z 231. I作为定量离子；通过观察标记的脂肪酸的成对质谱峰进行识别，并根据其相对峰面积即可定量分析。9.如权利要求6所述的用途，其特征是所述的脂肪酸的分析。此方法包括下列步骤a)脂肪酸分别与轻重标记试剂反应，后处理后进行LC-MS/MS分析，并选取产物离子m/z225. I和m/z 231. I作为定量离子。全文摘要本专利技术涉及一种哌嗪基嘧啶类同位素标记试剂的应用。所述的同位素标记试剂为轻质和重质的同位素标记试剂-/-2，4-二甲氧基-6-哌嗪基嘧啶。该试剂应用于脂肪酸、多肽或蛋白质等的含羧基化合物的比较分析中。1.脂肪酸的分析，包括下列步骤a)脂肪酸分别与轻重标记试剂反应，后处理后进行LC-MS/MS分析，选取产物离子m/z 225和m/z 231作为定量离子。b)通过观察标记的脂肪酸的成对质谱峰即可对多种含羧基脂肪酸进行识别，根据其相对峰面积即可定量。2.多肽蛋白质比较分析，包括下列步骤a)目标分析蛋白质等经过热变性、酶解后与前述的轻质或重质同位素标记试剂反应。b)将反应后的溶液进行后处理，进行MALDI-TOF MS比较分析。文档编号G01N27/62GK102944604SQ20121024958公开日2013年2月本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种哌嗪基嘧啶类同位素标记试剂的用途，哌嗪基嘧啶类同位素标记试剂具有如下结构式：，其中，X=H或D，其特征是用于含羧基有机化合物的快速标记及质谱分析。FDA00001902499500011.jpg
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭寅龙，冷嘉鹏，张立，张菁，王昊阳，张芳，康文昱，许楚，
申请(专利权)人：中国科学院上海有机化学研究所，
类型：发明
国别省市：
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