一种利用RNAi技术培育抗多种病毒烟草的方法，通过对GenBank中4种病毒（CMV、PVY、PVX、TMV）的多条基因组全长序列进行比对，筛选到4种病毒在基因组范围内的相对保守区域；最终选定各病毒序列，人工合成800bp的嵌合基因；依此构建了嵌合基因的RNAi植物表达载体，通过农杆菌转化普通烟草，获得转基因植株。本发明专利技术的特点是：以我国四种主要烟草病毒为对象，利用植物基因工程技术将人为构建的包含四种病毒序列的发夹状结构转入烟草中，使烟草转录出的发夹状双链RNA结构在植物自身机制下剪切成小RNA（siRNA），特异性地干扰、降解或沉默靶标病毒基因在烟草植株体内的正常复制和积累，筛选获得抗多种烟草病毒的烟草新材料。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物植物基因工程
，具体是,主要是针对烟草黄瓜花叶病毒mosaic virus, CMV)、烟草马铃薯 Y 病毒(/biaio Y virus, PVY)、烟草普通花叶病毒病(TbAacco mosaic virus, TMV)和烟草马铃薯X病毒病G0Oiaio virus X，PVX)的RNA干涉载体构建方法、及其在烟草上应用。
技术介绍
病毒病是烟草生产中不可忽视的病害，是造成烟草生产损失的重要原因。我国主要病毒病种类有TMV、CMV, PVY, PVX和烟草蚀纹病etch virus, TEV)等。20世纪60年代以前，全国烟区都以TMV危害最重；70年代以后，在黄淮烟区尤其是山东的CMV危害迅速上升，1974-1977年以CMV为主及CMV与TMV复合侵染，连续3年大流行，而在南方烟区和北方烟区仍以TMV为主要病害；20世纪80年代以后，不仅CMV在中、南部烟区危害继续上升，各类病毒病交替或同时流行危害，PVY开始发现，并逐年加重，已成为又一个主要病毒病害，与CMV、TMV混合发生、复合侵染。据统计，2008年我国病毒病造成的烟叶产值损失占病虫害总损失的23. 4%。病毒侵染烟草后造成的花叶、坏死等症状对烟叶质量产生重大损害。针对烟草病毒病发生的日趋严重，人们采用各种手段对其进行防治。然而，抗病品种的选育存在着培育时间长、容易出现抗性丧失等问题；农业措施往往只能减少或预防病毒初侵染源；化学药剂方面，目前还没有很好的方法能治疗烟草病毒病，主要也是以防治病毒传播介体为主要手段，化学农药存在着防效低、在作物上的残留多、对人畜有害及对环境造成污染等，目前用于防治病毒病害的农药制剂虽多，但是真正的有效成分和剂型很有限；生物防治方面在生产上的真正应用还很少。各种实践经验以及研究表明，通过育种或抗病毒基因工程方法使植物体本身具备病毒抗性是防治病毒最为有效的方法。近年来,RNA干涉(RNA interference, RNAi )技术在抗病毒研究中倍受关注，RNAi是一种基因沉默新技术，即人为地将与病毒基因同源的双链RNA导入寄主，引起与其同源的病毒基因发生沉默，从而达到抑制病毒复制的目的。对动植物而言，RNA干扰是植物调控内源基因表达和防御外源核酸入侵的重要机制。
技术实现思路
本专利技术以我国四种主要烟草病毒(TMV、CMV、PVY和PVX)为对象，利用植物基因工程技术将人为构建的包含四种病毒序列的发夹状结构转入烟草中，使烟草转录出的发夹状双链RNA结构在植物自身机制下剪切成小RNA (siRNA)，特异性地干扰、降解或沉默靶标病毒基因在烟草植株体内的正常复制和积累，筛选获得抗多种烟草病毒的烟草新材料，为利用RNAi介导的烟草抗病毒烟草育种工作提供了经验和实例。基于上述目的，本专利技术提供了一种可供农杆菌遗传转化烟草、针对多种烟草病毒的RNAi载体构建方法，该载体包含致病病毒CMV的RNA2-2B基因、PVY的HC-Pro基因、PVX的CP基因和TMV的CP基因部分保守核苷酸序列，以及利用该载体遗传转化烟草获得抗病毒烟草。该技术方法的建立将为烟草抗病毒育种工作提供一种新的策略和思路。本专利技术目的是通过以下技术方案来实现的 ，通过对GenBank中4种病毒(CMV、PVY,PVX,TMV)的多条基因组全长序列进行比对，筛选到4种病毒在基因组范围内的相对保守区域；最终选定各病毒序列，连接成800bp的嵌合基因；依此构建了嵌合基因的RNAi植物表达载体，通过农杆菌转化普通烟草，获得转基因植株，经检测得到转化成功的植株。 具体步骤如下 I)嵌合基因的设计与合成 通过对GenBank中4种病毒(CMV、PVY、PVX、TMV)的多条基因组全长序列进行比对，筛选4种病毒基因组范围内的多个相对保守区域，针对CMV的2B、PVY的HC-PRO、TMV和PVX的CF基因(编码外壳蛋白coat protein)区域各筛选确定200bp片段。4段序列连接成总共800 bp的序列，排列顺序为TMV-PVX-CMV-PVY，人工合成全长嵌合基因。2) RNAi载体构建 (O内含子的选取 人工构建发夹结构表达载体，需要在反向重复序列中间插入内含子来稳定转录形成的发夹结构，本专利技术克隆在烟草细胞内普遍表达较为稳定的细胞色素作邪基因的内含子，设计引物5p450和3p450扩增得到内含子，连接至克隆载体，用于RNAi载体构建。(2)构建发夹结构 根据已有的克隆载体PBlueScript KS II和植物表达载体pBIN219中多克隆位点(MCS)情况，选择引物上的酶切位点，同时避免涉及800 bp和内含子中包含的酶切位点，据此设计了含有不同酶切位点的引物用以扩增各个片段，引物序列见下表 引物I序列I酶切位点 5p450~GTACATATCACTTTAATTCA 3p450~CTGATTGTGCAATACATATTW ihpl_ CGGGA T^CCGGTGTACAGGTACAATGCGGBamffl i hp2_ CCGCT1C^gTCAAAAAGAAATTATTCAGAAIho I ihp3~ ACGCgT1C^aCAAAAAGAAATTATTCAGAA~Sall i hp4_ GG^gCT1CGGTGTACAGGTACAATGCGGKpn I inti CCGC/TiS^GTACATATCACTTTAATTCAltiol int2 |ACGC6TC(￡4CCTGATTGTGCAATACATATT\Sall 在用于扩增800bp嵌合基因的引物中引入I和N, Xho I和命I位点，用于扩增内含子的引物中引入V和通ο I位点，通过双酶切，首先将正向800 bp连接至克隆载体，转化大肠杆菌DH5 α ;通过菌落PCR及质粒酶切鉴定得到已插入目的片段的阳性克隆，内含子和反向800 bp以同样的方式，将嵌合基因与内含子依次连接至克隆载体，构成载体pBS-ihp。通过双酶切能够得到大小约为2000 bp、具有反向重复结构的DNA片段；经过测序证实所得片段确为目的发夹结构，且方向无误，不存在突变位点。(3)构建植物表达载体 为使发夹结构在植物细胞内具有较高的转录水平，本实验选择含有35S启动子和nos终止子的PBIN219作为表达载体，PBIN219含有的35S启动子能够在植物细胞能高水平转录，而NPTII基因使其具备卡那霉素筛选抗性，在NPTII基因和nos终止子两端的边界序列(LB和RB)能够使农杆菌在侵染植物细胞时，将该序列之间的T-DNA整合至植物基因组；将上一步骤中获得的2000 bp左右片段双酶切从克隆载体上切下，连入pBIN219的多克隆酶切位点，转化大肠杆菌DH5 α，构建为pBIN-ihp。3)抗病毒转基因烟草的培育 将构建成功的表达载体pBIN-ihp利用冻融法直接导入农杆菌LBA4404，挑取携带重组 质粒的农杆菌单菌落培养至0D_=0. 6-0. 8，使用叶盘法转化无菌苗烟草，经农杆菌浸泡的叶片于弱光下暗培养2天，然后转入含有卡那霉素的MS分化筛选培养基中培养，每隔7天更换一次培养基以保证养分供应，约10天后在叶片边缘开始有愈伤组织形成，一个月后，愈伤组织上分化出小芽，长至长约lcm，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用RNAi技术培育抗多种病毒烟草的方法，其特征在于：通过对GenBank中4种病毒CMV、PVY、PVX、TMV的多条基因组全长序列进行比对，筛选到4种病毒在基因组范围内的相对保守区域；最终选定各病毒序列，连接成800bp的嵌合基因；依此构建了嵌合基因的RNAi植物表达载体，通过农杆菌转化普通烟草，获得转基因植株，经检测得到转化成功的植株。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨军，张俊祺，宋纪真，王燃，罗朝鹏，李锋，魏春阳，曹培健，林福呈，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：
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