本发明专利技术公开了乳酸乳球菌Nisin免疫耐受相关基因irpT（其核苷酸序列如序列表所示）。属于微生物生物技术领域。本发明专利技术与乳酸乳球菌Nisin免疫耐受研究息息相关，此基因大小为708bp，国际上对该基因的功能没有报道。实验发现该基因的失活能够使乳酸乳球菌对Nisin的耐受性增强，研究发现其作用机制通过调节细胞壁的合成来增强Nisin耐受性。通过对Nisin耐受相关新基因的深入研究，可以进一步解释Nisin耐受的网络调控机制，为构建Nisin高产工程菌提供基础及理论依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物生物
，特别涉及一种乳酸乳球菌Nisin免疫耐受相关基因，即irpT基因。
技术介绍
乳链菌肽Nisin高效、安全、无毒,是国际公认的最为安全的生物防腐剂，广泛应用于食品和医药行业，对于提高食品安全性、防治细菌性疾病有着重要作用。Nisin可以抑制绝大多数革兰氏阳性菌，主要通过抑制细胞壁合成，即形成穿膜孔道、引起胞内小分子物质外泄、诱导细菌自溶酶释放或抑制孢子形成四种方式。为避免对自身菌体的破坏，由Nisin基因簇编码的NisI和NisFEG四个蛋白协同作用，为产Nisin的乳酸乳球菌提供了免疫保护。但近几年的研究表明，不产Nisin的乳酸乳球菌也可以被诱导产生对Nisin的耐受性，说明Nisin的免疫耐受系统是一个复杂的调控网络。因此，在Nisin基因簇中的基因，乳酸乳球菌中还有很多基因参与免疫耐受性的调控。有许多基因共同参与，这些基因的功能有的是已知的，有些还有待研究，对Nisin免疫耐受性相关基因的研究有助于了解Nisin免疫耐受性的网络调控机制，通过对Nisin耐受相关新基因的深入研究，可以进一步解释Nisin耐受的网络调控机制，为构建Nisin基因工程菌、提高Nisin工业产量、降低生产成本提供理论指导，有着重要的理论和现实意义。
技术实现思路
本专利技术目的是提供与乳酸乳球菌Nisin免疫耐受相关的基因，即irpT基因，为构建Nisin高产的基因工程菌提供理论依据。本专利技术提供的乳酸乳球菌Nisin免疫耐受相关的基因irpT基因，具有如序列表所示核苷酸序列，其基因长度为708bp。上述的提供的乳酸乳球菌Nisin免疫耐受相关的irpT基因，可以进一步解释Nisin耐受的网络调控机制，并且为构建Nisin高产的基因工程菌提供理论依据。本专利技术基因的获得方法使用人工Mu转座技术(一种基于噬菌体Mu转座子的转座技术)，造成乳酸乳球菌N8基因突变，建立突变子文库。筛选Nisin耐受增强的突变子，使用限制性内切酶Pvu II对基因组DNA，酶切，酶切片段与pUC18载体连接，通过电转化将连接产物导入大肠杆菌DH5 α，用氨苄青霉素LB平板筛选阳性转化子，测定转化子中插入片段的核苷酸序列，发现Mu插入的基因，确定此基因与Nisin免疫耐受有相关性。本专利技术的优点和有益效果实验发现本专利技术基因的失活能够增强乳酸乳球菌对Nisin的免疫耐受性。Mu插入失活基因使细菌对Nisin的免疫耐受性显著增强，说明此基因与乳酸乳球菌Nisin的免疫耐受性相关，这可以进一步解释Nisin耐受的网络调控机制，并且为构建Nisin高产的基因工程菌提供理论依据。通过本专利技术，可以针对irpT基因设计突变及敲除方法，限制其正常表达，使得乳酸乳球菌对Nisin的免疫耐受性显著增强，利于工业上的高效发酵生产。附图说明图I是乳酸乳球菌N8和乳酸如球菌irpT: :Mu N8 Nisin MIC (IU/ml)检测。图2是Mu转座子PCR产物电泳图(用PCR方法检测转化子的Mu转座子)；泳道I为负对照，模板为乳酸乳球菌NS基因；泳道2为正对照，模板为Mu转座子DNA的质粒pLEB620 ；泳道M 为 DNAmarker ；泳道4-6为随机挑选的乳酸乳球菌N8突变株。 用EeyMul和EeyMu2作为引物，可以扩增出730bp的特异性片段，确认Mu转座复合物DNA片段的存在。图3是乳酸乳球菌N8irpT: :Mu N8基因组单点插入Southern杂交检测；泳道I为PvuII酶解的乳酸乳球菌N8基因组；泳道2为红霉素Mu转座子片段；泳道3为PvuII酶解的乳酸乳球菌N8 irpT: :Mu N8基因组；泳道4为EcoRI酶解的乳酸乳球菌N8 irpT: :Mu N8基因组。具体实施例方式实施例I :使用Mu转座技术进行突变子文库的建立(I)Mu转座复合物的制备在25 μ I反应体系内，加入I. Ipmol人工Mu转座子DNA，4. 9pmolMuA转座酶和2.5μ I 的 IOX 反应缓护液(150mM Tris. Hcl, pH6. 0,50%(V/V)甘油，O. 025 (W/V) TritonX-OO, 150mM NaCl，0. ImM EDTA)，30°C水浴中，反应 2h，制得 Mu 转座复合物。(2) Mu转座酶复合物的检测取5 μ I按上述方法制备的Mu转座复合物，在含有87 μ g/mL BSA, 87 μ g/mL肝素的2%(w/V)琼脂糖凝胶中电泳，电泳缓冲液为ΙχΤΑΕ，电场强度为4V/cm，电泳时间为2. 5h。I)取I μ IMu转座复合物，用无菌去离子水适当稀释，加入到L. Iactis Ν8感受态细胞中，每管细胞复合物用量从60ng到600ng，以30ng为间隔；2) 12kV/cm电压电击，30°C静置培养2h，涂布SR平板；3)30°C静置培养72h后，将转化子转接到含5ug/mL红霉素的SGM17平板，30°C静置过夜培养。(3)从过夜培养的SGMl7平板上挑取数个菌落，分别接种到Im L的SGMl7中，30°C静置培养16-18h，取I μ I菌液做模板，以EryMul和EryMu2为引物，用PCR方法扩增Mu转座子片段，引物序列为EryMul, 5J GGGATTCGTCATGTTGGT 3，EryMu2，5，GTGGTATGGCGGGTAAGT 3，。PCR 体系为PCR Buffer 2 μ 1，dNTPl. 5 μ 1，EryMul I μ I, EryMu2 I μ I,菌液Iμ I, Taq酶O. 2 μ I,用无菌去离子水补至20 μ I。扩增条件为，94°C预变性15min，94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，共30个循环，最后72°C延伸IOmin。PCR产物用O. 8%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外灯下观察结果并留照片，具有Ery抗性基因的转化子即为Mu转座复合物转化子。实施例2 = Nisin耐受性检测米用最小抑菌浓度(MinimumInhibitory Concentrations,MIC)检测.配制含有一系列Nisin效价(0-7000IU/mL)的液体SGM17培养基，按1%比例将30°C静置过夜培养的乳酸球菌菌液接种到这些SGM17培养基中，注入无菌96孔板中，密封30°C静置培养24h后观察乳酸乳球菌的生长情况，并用酶标仪在595nm下检测培养基浊度，浊度增长不超过10%的作为耐受性的临界值。并按.照Takala和Saris所述生长曲线检测法，检测在不同Nisin效价(0-7000IU/mL)下乳酸乳球菌的耐受性(见图I)。 实施例3 :乳酸乳球菌N8Nisin免疫耐受相关基因的克隆I、Mu转座复合物转化子基因组DNA的提取I)从菌种甘油保存管中接菌至含相应抗生素的SGM17平板，30°C静置过夜培养；挑取新鲜划线培养的单菌落，接种到5mL含相应抗生素的SGM17液体培养基中，30°C静置培养 16-20h;2)按1:100接种于201^含相应抗生素的561117液体培养基中，301静置培养811;3)将菌液转移至50mL离心管中，4°C , 12000rpm离心lmin,收集菌体；4)在离心管中加入 2mL 裂解本文档来自技高网...
【技术保护点】
乳酸乳球菌Nisin免疫耐受相关的基因irpT，其核苷酸序列如序列表所示，其基因长度为708bp。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：乔明强，赵凯，朱多龙，张续，冯舟，轩辕铮铮，白艳玲，徐海津，张秀明，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：
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