本发明专利技术公开了具有肿瘤细胞杀伤活性的端粒蛋白多肽片段及其应用。本发明专利技术所提供的多肽是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与肿瘤细胞杀伤活性相关的由序列1衍生的多肽。实验证明，表达本发明专利技术所提供多肽的重组腺病毒能够抑制端粒酶阳性的肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤体内外生长。这表明本发明专利技术的多肽具有广谱、特异性端粒酶阳性肿瘤细胞杀伤活性，同时该多肽对正常人体细胞的生长和生存没有影响。这将对新型广谱特异性抗肿瘤药物的研发具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及具有肿瘤细胞杀伤活性的端粒蛋白多肽片段及其应用。
技术介绍
端粒是细胞染色体末端标志，由端粒DNA和端粒蛋白组成。端粒蛋白包括Potl、TPPl、Tin2、TRFl、TRF2和RAPl。这六种蛋白在端粒DNA上相互作用，形成多种形式端粒蛋白复合体，对保护端粒DNA不被细胞错误识别为染色体损伤断端和引发染色体末端DNA损伤反应有重要作用。端粒蛋白复合体的功能性结构受端粒DNA序列长度调控。人体正常细胞由于缺乏端粒酶活性，端粒DNA长度随细胞分裂次数增多而发生逐渐缩短，最终导致端粒蛋白复合体功能性结构丧失，引发细胞染色体末端DNA损伤反应,诱导细胞衰老或凋亡。因此人体正常细胞只具备有限次数的分裂倍增能力，不能无限繁殖。相反，阻断端粒DNA随细胞分裂而缩短的趋势，获得永久性端粒蛋白染色体末端保护能力，是所有人类细胞癌变 的一个重要步骤，是肿瘤细胞形成永生化恶性生长能力的共同基础。大量研究已经证明诱导端粒蛋白复合体功能障碍具有广谱、完全的肿瘤抑制效应，是治疗人类肿瘤性疾病的一条潜在途径。但关键问题是寻找出能够特异性攻击肿瘤细胞的端粒蛋白复合体而不影响正常细胞端粒蛋白复合体的结构和功能的治疗靶标和药物。在已经鉴定出的六种端粒组成型结构蛋白中，Potl是主要用于抑制ATR在端粒上介导的单链DNA损伤反应活化的专业化端粒保护性蛋白(Drik H, et al. Telomereprotection by mammalian Potl requires interaction with TppLNat struct. Mol.Biol. 14(2007) :754-761.以及 Zimmerman S，UM Martens. Telomeres and telomerase astargets for cancer therapy. Cell Mol Life Sci 2007 (64) :906-21. ) 全长 Potl 蛋白由634个氨基酸组成，分为两个主要功能结构域，一是N-端OB fold结构域与端粒单链DNA的特异高亲和力结合；另一个是C-端与另一种端粒结构蛋白TPPl结合结构域。Potl与TPPl相互作用是介导Potl端粒定位的主要机制。但有关Potl在端粒上如何抑制ATR的作用机制并不清楚。以往研究发现去除Potl N端的OB fold结构域并不影响剩余的Potl片段(Potlaal21-634)在细胞中的端粒定位，同时在肿瘤细胞中表达Potlaal21_634片段能促进端粒酶延长端粒DNA和稳定肿瘤细胞端粒的效应。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有广谱特异肿瘤细胞杀伤活性的端粒蛋白多肽片段及其应用。本专利技术所提供的多肽，名称为PotlClOO，由Potl蛋白C-末端的114个氨基酸残基组成,具体来说，PotlClOO是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与肿瘤细胞杀伤活性相关的由序列I衍生的多肽。由所述多肽PotlClOO衍生的蛋白质也属于本专利技术的保护范围。在本专利技术中，所述蛋白质具体为由序列表中序列4所示氨基酸序列组成的蛋白质。该蛋白质，是在所述多肽PoticiOO的N端连接上绿色荧光蛋白(EGFP)后所形成的融合蛋白(命名为EGFP-Pot 1C100 )。其中，序列I由114个氨基酸组成；序列4由355个氨基酸组成，其中第242-355位对应序列I。编码所述多肽PotlClOO或所述融合蛋白EGFP-PotlClOO的核酸分子也属于本专利技术的保护范围。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。在本专利技术的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述多肽的基因(命名为·PotlClOO)或编码所述融合蛋白EGFP-PotlClOO的基因(命名为EGFP-PotlClOO);所述基因是如下I) -4)中任一所述的DNA分子I)编码序列为序列表中序列2的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)编码序列为序列表中序列5所示的DNA分子；4)序列表中序列5所示的DNA分子。其中，序列2由345个核苷酸组成，编码序列表中序列I所示的多肽；序列5由1068个核苷酸组成，编码序列表中序列4所示的蛋白质。序列5的第1-717位为EGFP蛋白的编码基因(不含终止密码子)，对应序列表中序列3，第718-723位为Bgl II的识别序列，第724-1068位为PotlClOO基因(不含起始密码子)，对应序列表中序列2。含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、重组细胞、重组菌或重组病毒也属于本专利技术的保护范围。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。在本专利技术中，所述重组表达载体中启动所述EGFP-PotlC100基因或所述PotlClOO基因转录的启动子具体为MCMV启动子。更为具体的，所述重组表达载体可为在pDC316载体或pDC315载体的多克隆位点处插入所述EGFP-PotlC100基因或所述PotlClOO基因得到的重组质粒。在本专利技术的一个实施例中，所述重组表达载体具体为在pDC316载体的多克隆位点处插入所述PotlClOO基因以及EGFP蛋白的编码基因得到的同时表达所述PotlClOO多肽和所述EGFP蛋白的重组质粒(命名为pDC316-EGFP-Pot 1C100)。其中，插入所述PotlClOO基因(不含起始密码子)的多克隆位点具体为BlII和Sal I ;插入所述EGFP蛋白的编码基因的多克隆位点具体为EcoR I和Bgl II。即所述重组表达载体具体为在PDC316载体的多克隆位点EcoR I和Sal I之间插入所述EGFP-PotlClOO基因(序列5)。所述表达盒由能够启动所述EGFP-PotlClOO基因或所述PotlClOO基因表达的启动子，所述EGFP-PotlClOO基因或所述PotlClOO基因，以及转录终止序列组成。在本专利技术的一个实施例中，所述重组病毒具体为携带并表达所述EGFP-PotlClOO基因或所述PotlClOO基因的重组腺病毒。在本专利技术中，所述重组腺病毒是基于Ad-MAX包装系统构建得到的，具体可按照包括如下步骤将所述重组表达载体(在PDC316载体或pDC315载体(与pDC316载体相比，仅多克隆位点存在差异)的多克隆位点处插入所述EGFP-PotlClOO基因或所述PotlClOO基因得到的重组质粒)与骨架质粒PBH Glox ΔΕ1, 3Cre共转染腺病毒包装细胞得到重组细胞甲；培养所述重组细胞甲，获得所述重组腺病毒。在本专利技术的一个实施例中，所述重组表达载体具体为所述重组表达载体pDC316-EGFP-PotlC100 ;所述腺病毒包装细胞具体为HEK293 细胞。当然，基于其他腺病毒包装系统构建得到的表达所述PotlClOO多肽的重组腺病毒也属于本专利技术的保护范围。上述多肽，或核酸分子，或重组载体，或表达盒，或重组细胞，或重组菌，或重组病毒在制备下述任一产品中的应用也属于本专利技术的保护范围(I)诱导肿瘤细胞凋亡的产品；(2)抑制本文档来自技高网...
【技术保护点】
多肽，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与肿瘤细胞杀伤活性相关的由序列1衍生的多肽。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄君健，金蕊，白云秀，马航航，徐晓玲，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：
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