能够特异性结合Aβ 寡聚体的抗体及其应用制造技术

本申请涉及能够特异性结合Aβ寡聚体的抗体及其应用。本发明专利技术人成功地生产了仅特异识别作为生理性分子的可溶性Aβ寡聚体而不识别可溶性Aβ单体的单克隆抗体。发现该抗体可以用作针对阿尔茨海默氏病诊断/治疗的单克隆抗体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及可特异性地结合A β寡聚体的抗体及其应用。
技术介绍
多种证据已显示，记忆的衰退起因于由可溶性Αβ寡聚体触发的突触功能障碍(参见非专利文献I和2)。A β寡聚体的过量积聚和沉着可触发一系列病理学级联反应，导致阿尔茨海默氏病(AD)。因此，靶向Αβ寡聚体的治疗介入对阻断这些级联反应可能是有效的。然而，对于该导致神经退行性变淀粉状蛋白级联的假说中，由核心分子特别是由Αβ寡聚体介导的神经变性的实验证据来自体外实验(参见非专利文献3)。该神经变性未在体内得到直接证实。之前报道的体内实验最大的缺陷在于它们无法证明内源Αβ寡聚体的突触毒性，这是由于缺乏对构象具有特异性的分子工具(参见非专利文献4)。在阿尔茨海默氏病小鼠模型中亦难以解决的问题，还没有办法在人类脑内解决。因而，内源Αβ的体内神经毒性往往受到忽视。为何在人类内嗅皮质中的NFT形成和神经细胞丧失发生于老年斑形成之前，以及Αβ如何涉及该机制，人们都尚不知晓。涉及现行专利技术的现有技术文献信息如下所示Klein WL, Trends Neurosci. 24:219-224，2001 Selkoe DJ, Science 298:789-791，2002Hass C et al. :Nature Review 8:101-12, 2007 Lee EB, et al. : J. Biol. Chem. 281:4292-4299，2006_9] 本专利技术的公开本专利技术是鉴于上述情况完成的。本专利技术的一个目的为提供可特异性地结合Αβ寡聚体的抗体及其应用。更加具体而言，本专利技术提供了可特异性地结合Αβ寡聚体的抗体，以及使用该抗体检测Αβ寡聚体的方法，使用该抗体诊断阿尔茨海默氏病的方法，以及包含该抗体的药剂。本专利技术人产生了这样的单克隆抗体，它们仅对可溶性淀粉样蛋白β (Αβ)寡聚体具有特异性，而不识别属于生理性分子的可溶性A β单体，此外，本专利技术人确证了所述抗体具有(I)抗神经毒性活性；(2)阻抑Αβ淀粉样蛋白原纤维形成的活性；(3)仅识别Αβ寡聚体的特异性；(4)在AD脑中捕获A β寡聚体的能力；以及(5)预防类阿尔茨海默氏病表型(记忆障碍，脑部Αβ积聚)在APPswe转基因小鼠(Tg2576)中发展的能力。使用超滤/分子筛方法，在产生的抗体中，确定了单克隆抗体1A9和2C3特异性的识别30kDa或更大，主要为IOOkDa或更大的寡聚体，但不识别大约4. 5kDa左右的单体。通过测量两种抗体在已分化为神经细胞的PC12细胞中针对Αβ 1-42-诱导的神经毒性的中和作用，确证了它们具有神经毒性中和活性。硫代黄素T测定和电子显微镜观察显示所述抗体具有阻抑Αβ淀粉样蛋白原纤维形成的活性。通过使用1Α9和2C3在具有SDS稳定性的4-,5-,8-以及12- 聚体的存在下进行免疫沉淀反应,确证了这些抗体在AD脑中捕获Αβ寡聚体的能力。进一步，为确定在人脑中的体内神经毒性，对在主要为Braak NFT I到III期的人类内嗅皮质中所述抗体识别的多聚体的量进行了测量。对据报道在动物研究中具有神经毒性的12-聚体加以特别关注，结果确证了该多聚物的积聚发生于认知障碍出现之前，并随着Braak NFT期的进展而增加。该结果首次显示，被所述抗体所特异性识别的所述12-聚体是一种构象聚合体(conformational assembly),在人脑中导致体内神经毒性。本专利技术人亦发现由所述抗体识别的寡聚构象结构存在于脑脊液(CSF)中，并在AD患者中增力口。本专利技术人将1A9或2C3和其它神经病症同样地通过静脉内注射作为被动免疫治疗使用。经确证通过亚慢性被动免疫治疗保护了 Tg2576小鼠免于罹患记忆缺陷、老年斑形成、突触障碍和Αβ积聚，且无有害副作用。本专利技术人获得的该结果首次说明，单克隆1Α9和2C3很有希望被选择作为在Tg2576小鼠中预防类阿尔茨海默氏病表型的治疗抗体，其可望通过常规外周静脉内给药显示其效应，从而无需考虑脑内转移(brain transfer)的问题。本专利技术人亦确证使用所述1A9和2C3抗体的被动免疫疗法可阻抑老年斑淀粉状蛋白形成以及肿大变性的神经突形成。进一步，本专利技术人发现投入血液的1A9和2C3中有一部分转移入脑部。如上所述，本专利技术人在本文中公开了单克隆1A9和2C3——它们是特异性结合Αβ寡聚体的抗体——符合了所有诊断性/治疗性抗体的标准，并且是供诊断/预防阿尔茨海默氏病的治疗抗体的有望候选。进一步，与所述1Α9和2C3抗体相似，本专利技术人成功获取了 5A5、5A9、4F7、4H5、6E4和6H4抗体，这些抗体特异性地结合A β寡聚体，但不识别A β单体。本专利技术人发现这六种类型的抗体具有中和Αβ诱导的神经毒性，以及阻抑Αβ淀粉样蛋白微纤维形成的活性。本专利技术人公开了上述5A5、5A9、4F7、4H5、6E4和6H4抗体是供诊断/预防阿尔茨海默氏病的治疗抗体的有望候选。更加具体而言，本专利技术提供了下述 一种可结合Αβ寡聚体的抗体，所述Αβ寡聚体可结合包含具有SEQID NO: I的氨基酸序列的H链和具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的L链的抗体； 一种可结合Αβ寡聚体的抗体，所述Αβ寡聚体可结合包含具有SEQID Ν0:21的氨基酸序列的H链和具有SEQ ID NO: 23的氨基酸序列的L链的抗体； 一种可结合A β寡聚体的抗体，所述A β寡聚体可结合包含具有SEQID NO:41的氨基酸序列的H链和具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的L链的抗体； 一种可结合A β寡聚体的抗体，所述A β寡聚体可结合包含具有SEQID NO:61的氨基酸序列的H链和具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的L链的抗体； 一种可结合A β寡聚体的抗体，所述A β寡聚体可结合包含具有SEQID NO:81的氨基酸序列的H链和具有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的L链的抗体； 一种可结合Aβ寡聚体的抗体，所述Aβ寡聚体可结合包含具有SEQID NO: 101的氨基酸序列的H链和具有SEQ ID NO: 103的氨基酸序列的L链的抗体；下述(I)到(38)中任一项的抗体(I) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列作为CDR1，SEQID NO: 11的氨基酸序列作为⑶R2，以及SEQ ID NO: 13的氨基酸序列作为⑶R3的H链； (2) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO: 15的氨基酸序列作为CDR1，SEQ ID NO: 17的氨基酸序列作为⑶R2，以及SEQ ID NO: 19的氨基酸序列作为⑶R3的L链；(3) 一种抗体，其包含⑴的H链和⑵的L链；(4) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列作为VH的H链；(5) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO: 7的氨基酸序列作为VL的L链；(6) 一种抗体，其包含(4)的H链和(5)的L链；(7) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列作为CDRl、SEQ ID NO:31的氨基酸序列作为⑶R2、以及SEQ ID NO: 33的氨基酸序列作为⑶R3的H链；(8) 一种抗体，其包含具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列作为CDRl，SEQ ID 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结合Aβ寡聚体的抗体，所述Aβ寡聚体可结合包含具有SEQ？IDNO:81的氨基酸序列的H链和具有SEQ？ID？NO:83的氨基酸序列的L链的抗体。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：松原悦朗，柴田昌夫，横关达己，
申请(专利权)人：伊缪纳斯制药株式会社，独立行政法人国立长寿医疗研究中心，
类型：发明
国别省市：