用于生成具有单链悬突的双链核酸的方法技术

本发明专利技术提供双链扩增产物的构造与一个或两个单链悬突结合的方法，该方法提高了上述靶扩增产物的生产。单链悬突能被用于后扩增捕获和随后的检测/操作。单链悬突能够在没有来自双链靶扩增产物中互补链的干扰的情况下捕获/检测/操作。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
在分子生物学及相关领域，通常希望制备诸如可与寡核苷酸（例如捕获探针）相互作用的PCR产物的双链核酸。这可通过例如升高温度或提高pH直到双链核酸变性而使核酸的两条链被分开来完成。变性后，可添加捕获探针并逆转条件从而使捕获探针的退火能够发生。然而，如果两条链依然存在于样品中，它们可能复性，显然会与捕获探针进行竞争。这当然就降低了捕获过程的效率。一种解决方案是在用捕获探针捕获链中的一条前物理分开核酸的两条链。然而，这需要额外的操作，这样花费时间并且还可能导致材料的损耗。因此，在PCR中将会有利的是，阻止DNA聚合酶一直复制到模板的3′末端，从而留下单链5′悬突（如US5525494（Zeneca Limited，1996年6月11日）中的记载）。阻断DNA聚合酶从而形成单链悬突的常见方式是在PCR引物与无意义寡核苷酸序列之间插入碳接头，但这种方式对本专利技术获得的PCR效率和随后的捕获没有好处。与本专利技术相比，其缺点在于由于碳接头的非刚性结构，无意义寡核苷酸序列有翻回到靶核苷酸序列上的潜力-从而干扰PCR聚合酶。碳接头还可以卷起来，从而使无意义寡核苷酸序列和引物序列紧密靠近，使PCR聚合酶可通读接头。接头的上述干扰随后降低多重PCR试验的批间（inter-assay）均匀性，而由于所使用的聚合酶阻断剂（blocker）的刚性结构，本专利技术中没有见到上述干扰。WO9421820描述了一种PCR方法，该方法使用具有不可复制的区域的引物来生成具有单链悬突（尾）的PCR产物。专利技术者在PCR引物中使用两种非碱基类似物（1,3-丙二醇和1,4-脱水-2-脱氧-D-核糖醇）来阻止聚合酶复制用作引物的寡核苷酸的所有核苷碱基，从而留下与位于非碱基类似物的5’侧的核苷碱基对应的单链悬突。然而，WO9421820和US5525494没有公开在特异性和灵敏度方面对PCR反应有利或便于随后捕获PCR产物的聚合酶阻断剂。专利技术概述本专利技术提供双链靶扩增产物的构造与一个或两个单链悬突结合的方法，该方法提高了上述靶扩增产物的生产。单链悬突能被用于后扩增捕获和随后的检测/操作。单链悬突能够在没有来自双链靶扩增产物中互补链的干扰的情况下改善捕获/检测/操作。附图简述图1：变性的PCR产物或BFO修饰的PCR产物的检测结果作为PCR产物的数量的函数。对于两个检测体系，显示了通过DNA捕获寡核苷酸和对-TINA修饰的DNA捕获寡核苷酸进行的检测。更多信息，参见实施例1。图2：用在本专利技术中的示例性双官能寡核苷酸的示意图。图3：采用1（上图）和2双官能寡核苷酸的引物组的多重PCR的示意图。图4A显示了50nM时退火梯度上邻-TINA（第1排）和C3间隔基PCR（第2排）产物。详情参见实施例2。图4B显示了100nM时退火梯度上邻-TINA（第1排）和C3间隔基PCR（第2排）产物。详情参见实施例2。.图5A显示了200nM时退火梯度上邻-TINA（第1排）和C3间隔基PCR（第2排）产物。详情参见实施例2。图5B显示了400nM时退火梯度上邻-TINA（第1排）和C3间隔基PCR（第2排）产物。详情参见实施例2。图形6显示了邻-TINA和C3间隔基修饰的双官能寡核苷酸的Luminex捕获分析的结果。详情参见实施例2。
技术实现思路
本专利技术提供一种方法，包括如下步骤：a.提供模板核酸；b.提供双官能寡核苷酸（bfo），所述双官能寡核苷酸包含其3′末端的引物/模板（pt）区域（与所述模板核酸的部分互补）和捕获区域（cr），其中所述pt区域和所述cr区域被聚合酶阻块（B）（polymerase block）隔开；c.混合步骤a-b的组分并提供使所述bfo的pt区域与所述模板核酸退火的条件；d.在可使引物延伸的条件下，延伸所述bfo的pt区域；e.从而生成具有与所述bfo的cr区域对应的单链悬突（dso）的双链核酸。在优选的实施方案中，步骤b的bfo理解为：5′cr-B-pt 3′。在另一个实施方案中，步骤b的bfo理解为：X–B–pt 3′其中“X”可以为“cr”、“B”和“pt”的任何组合。例如，X=3′pt-B-cr 5′-B-5′cr（在这种情况下，该特定的bfo的式将会是：3′pt-B-cr 5′-B-5′cr-B-pt 3′）。优选地，步骤d中的延伸作为选自由如下反应组成的组的反应的一部分完成：靶指数扩增（例如聚合酶链式反应（PCR）、连接酶链式反应（LCR）、滚环式扩增）、等温靶指数扩增（例如基于核酸序列的扩增（NASBA）、链置换扩增（SDA）、转录介导的扩增（TMA））、靶线性扩增（例如反转录、双脱氧测序）。在一个实施方案中，所述模板核酸为RNA，因此所述聚合酶为反转录酶。PCR当所述方法为PCR时，将认识到所述方法进一步包括如下步骤：f.提供第二引物，所述第二引物与步骤d的第一延伸产物互补g.使步骤d的产物变性h.在使引物延伸的条件下，延伸与所述第一延伸产物退火的所述第二引物步骤f-h可称为第二链合成。在一个实施方案中，所述第二引物也是bfo。因此，第二bfo的pt区域启动（prime）第二链合成。第二bfo与第一bfo的代表性的不同点在于pt区域的序列和/或cr区域的序列。应理解的是，核苷酸类似物和修饰的核苷酸的长度、内容（content）以及聚合酶阻块的特征也可能不同。当第一和第二引物都是bfo时，所述方法的双链产物（扩增子）在两端都具有单链悬突（捕获区域）。聚合酶通常是热稳定的，以便可多次重复变性、退火和延伸。否则，将必须在每个变性步骤后添加聚合酶。正常地，重复2-45次、更优选5-35次、最优选10-30次。应理解的是，重复的次数通常取决于第一循环中模板核酸的量、所希望的最终产物量和所述过程的效率。多重在上面描述的涉及PCR的实施方案中，使用了两个引物。引物1为bfo，引物2可以为bfo或者可以为典型的PCR引物。无论哪种方式，所述的两个引物可称为引物组或引物对，所述引物组或引物对一起使某序列能够扩增而生成PCR产物（扩增子）。所述方法可使用多个引物对来代替仅使用一个引物对，从而使PCR反应为多重PCR。对于引物组2，有一个引物可以为bfo或者两个引物可以都为bfo，对于另外的引物组，同样如此。在一个实施方案中，当各引物组中所述引物中只有一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.05.07 DK PA201000403;2010.09.20 DK PA201000841.一种方法，包括以下步骤：
a.提供模板核酸；
b.提供双官能寡核苷酸（bfo），所述双官能寡核苷酸包含其3’末端的引
物/模板（pt）区域（与所述模板核酸的一部分互补）和捕获区域（cr），其中
所述pt区域和所述cr区域被聚合酶阻块（B）隔开；
c.混合步骤a-b的组分并提供使所述bfo的pt区域与所述模板核酸退火并
使所述B改善扩增的模板核酸的生产的条件；
d.在可使引物延伸的条件下，延伸所述bfo的pt区域；
e.从而生成双链核酸，所述双链核酸具有与所述bfo的cr区域对应的单
链悬突（dso）；
其中所述聚合酶阻块（B）包含嵌入剂并且能够描述为如下通式：
X-L-I
其中X为能掺入寡核苷酸或寡核苷酸类似物或者PNA或PNA类似物的
骨架中的骨架单体单元；L为接头；I为包含至少一个基本为平面的共轭体系
的嵌入剂，所述体系能够与DNA、RNA或其类似物的核苷碱基共堆积。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述嵌入剂为芘。
3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述嵌入剂存在于如下
通用结构Z描述的TINA单体中：
X-L-I1-C-I2其中，X为能掺入寡核苷酸或寡核苷酸类似物或者PNA或PNA类似物的
骨架中的骨架单体单元；L为接头；I1为包含至少一个基本为平面的共轭体系
的第一嵌入剂，所述体系能够与DNA、RNA或其类似物的核苷碱基共堆积；
C为任选的连接基；I2为包含至少一个基本为平面的共轭体系的第二嵌入剂，
所述体系能够与DNA、RNA或其类似物的核苷碱基共堆积。
4.如权利要求1所述的方法，其中X包含亚烷基二醇，L为包含烷基链、
氧杂烷基链、氮杂烷基链、硫杂烷基链、酰胺基、硫代酰胺基、磺酰胺基或者
它...

【专利技术属性】
技术研发人员：乌费·韦斯特·施奈德，戈姆·里斯比，
申请(专利权)人：昆特拜克股份公司，
类型：
国别省市：