稳定的α-半乳糖苷酶及其用途制造技术

本文公开了多聚蛋白质结构，包括通过连接部分彼此共价地连接的至少两个α-半乳糖苷酶单体，以及制备其的方法，和通过给予多聚蛋白质结构来治疗法布里病的方法。在溶酶体条件下和血清环境两者中，公开的多聚蛋白质结构在增强的活性和/或较长的持久活性方面表现出改进的性能。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术在其一些实施方式中涉及新的多聚蛋白质结构（多聚体蛋白结构），更具体地，但是非排他性地，涉及α-半乳糖苷酶的多聚蛋白质结构以及它在治疗法布里病（Fabry disease）中的应用。
技术介绍
在大分子的分解代谢期间，溶酶体酶α-半乳糖苷酶-A（α-GAL或α-GalA；EC 3.2.1.22）催化半乳糖从低聚糖、糖蛋白类以及糖脂中的去除。溶酶体酶的缺乏导致它们的底物在组织中的积聚，被称为溶酶体贮藏病的条件。在人类中，功能性α-半乳糖苷酶-A的缺乏导致在组织中含有末端α-半乳糖残基的糖脂的积聚（主要是糖鞘脂（脂酰鞘氨醇三己糖苷，globotriaosylceramide），其也被称为“神经酰胺三己糖苷”（酰基鞘氨醇己三糖苷酶，ceramide trihexoside）、“CTH”或“Gb3”），从而导致法布里病。法布里病是X-连锁隐性疾病，首先在1 898年被描述，其特征在于慢性疼痛、眼浑浊（ocular opacities）、肝和肾损伤、皮肤损害、血管恶化和/或心脏缺陷。重组人类α-半乳糖苷酶-A具有恢复患者体内酶功能的能力，并且美国在2003年将利用α-GAL的酶替代疗法（ERT）批准用于治疗法布里病。在β-葡萄糖苷酶，用于戈谢病（Gaucher disease）的治疗之后，α-GAL成为被批准的用于治疗溶酶体贮藏病的第二种重组蛋白质。在器官如肝、肾、脾、心脏等的细胞的溶酶体中，内源性的和重组的>α-GAL催化末端半乳糖苷化的糖脂的水解。这种自然的作用位点的特征在于它的低pH，达到低至4.5。因此包含α-GAL的溶酶体酶被设计成在这些低的pH水平上发挥它们的最大活性。目前的法布里ERT治疗是基于哺乳动物细胞来源的重组α-GAL，其被认为是效力有限的治疗。这些治疗仅减慢疾病的进展，但是不能终止它的进展，并且不能提供真实的和完全的解决方案。此外，在一些情况中，由于对治疗的免疫原性响应的发展，必需停止利用商业重组的α-GAL的ERT，并且在一些情况中，考虑到免疫原性问题，不能开始治疗。X-射线结构分析显示，人类α-GAL是同型二聚体糖蛋白，其中每一个单体由两个结构域组成，含有活性位点的(β/α)8结构域和在β夹心中的两个片上含有8个反平行的β链的C-末端结构域[Garman & Garboczi,J Mol Biol 2004,337:319-335]。以首-尾装配的形式来布置两个单体，并且二聚作用是非共价的。两个单体利用界面聚集在一起，其中所述界面延伸二聚体的宽度并埋置表面积的在二聚体界面中，来自每一个单体的30个残基有助于所述界面。将二聚体的两个活性部位分开大约将α-Gal的晶体结构解释为非配体的蛋白质以及半乳糖-配体的蛋白质。这两种结构在配体的和非配体的结构之间表现很小的变化。然而，使用半乳糖代替天然的底物，糖鞘脂（Gb3）不会导致活性部位协同性的迹象，其中后者的特征在于长脂质链能够与一种单体的疏水结构域相互作用，而末端半乳糖能够与第二单体的活性部位相互作用。此外，生物化学迹象表明这样的协同性，其举例说明了同型二聚体四维结构的重要性[Bishop & Desnick,J Biol Chem 1981,256:1307-1316]。因此，研究了人类α-Gal的动力学性质，并且显示了同型二聚体酶的单体之间的协同性，每一个具有相互作用的催化部位。因此，认为酶活性和稳定性可能取决于二聚作用。本专利技术的受让人的WO 2009/024977（如完全阐明的一样，将其全部内容结合于本文中作为参考）教导了糖类和生物分子的结合物（conjugates），它们之间是通过非疏水性连接子共价地连接，以及利用这样的结合物的医疗用途。本专利技术的受让人的PCT国际专利申请号PCT/IL2010/000956教导利用α-半乳糖苷酶的方法论，所述半乳糖苷酶在比溶酶体pH高的pH水平下表现溶酶体活性。另外的
技术介绍
包括Bendele等人[Toxicological Sciences 1998,42:152-157]、美国专利号5,256804、5,580757和5,766,897，国际专利申请PCT/NL2007/050684（作为WO 2008/075957公开的），以及Seely & Richey[J Chromatography A 2001,908:235-241]。
技术实现思路
根据本专利技术的某些实施方式的方面，提供了多聚蛋白质结构，其包括彼此通过连接部分共价地连接的至少两个α-半乳糖苷酶单体，该多聚蛋白质结构呈现选自由以下组成的组中的特性：（a）在使多聚蛋白质结构经受人类血浆条件1小时后的α-半乳糖苷酶活性比在使天然α-半乳糖苷酶经受人类血浆条件1小时后的天然α-半乳糖苷酶的活性高至少10％；（b）在使多聚蛋白质结构经受人类血浆条件1小时后的α-半乳糖苷酶活性减少的百分数比在使天然α-半乳糖苷酶经受人类血浆条件1小时后的天然α-半乳糖苷酶活性减少的百分数低至少10％；（c）在使多聚蛋白质结构经受人类血浆条件1小时后的α-半乳糖苷酶活性基本上保持不变；（d）在使多聚蛋白质结构经受溶酶体条件1周后的α-半乳糖苷酶活性，比在使天然α-半乳糖苷酶经受溶酶体条件1周后的天然α-半乳糖苷酶的活性高至少10％；（e）在使多聚蛋白质结构经受溶酶体条件1天后的α-半乳糖苷酶活性减少的百分数，比在使天然α-半乳糖苷酶经受溶酶体条件1天后天然α-半乳糖苷酶的活性减少的百分数低至少10％；（f）在使多聚蛋白质结构经受溶酶体条件1天后α-半乳糖苷酶活性基本上保持不变；（g）在使多聚蛋白质结构经受溶酶体条件之后即刻的α-半乳糖苷酶活性比在使蛋白质的天然形式经受溶酶体条件之后即刻的天然α-半乳糖苷酶的活性高至少10％；（h）在使多聚蛋白质结构经受具有7的pH和37℃的温度的水溶液之后即刻，α-半乳糖苷酶活性，比在使天然α-半乳糖苷酶经受具有7的pH和37℃的温度的水溶液之后即刻天然α-半乳糖苷酶的活性高至少10％；和（i）在生理系统中的循环半衰期至少比天然α-半乳糖苷酶的循环半衰期高20％。根据本专利技术的某些实施方式的方面，提供了多聚蛋白质结构，其包括通过连接部分（linking moiety）彼此共价连接的至少两种α-半乳糖苷酶单体，其中连接部分不存在于天然α-半乳糖苷酶中。根据本专利技术的某些实施方式的方面，提供了包括如本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.11.17 IL PCT/2010/000956;2010.03.02 US 61/3091.一种多聚蛋白质结构，包括通过连接部分彼此共价连接的至少两个
α-半乳糖苷酶单体，所述多聚蛋白质结构呈现选自由以下组成的组
中的特征：
（a）在使所述多聚蛋白质结构经受人类血浆条件1小时后的α-
半乳糖苷酶活性比在使天然α-半乳糖苷酶经受所述人类血浆条件1
小时后的所述天然α-半乳糖苷酶的活性高至少10％；
（b）在使所述多聚蛋白质结构经受人类血浆条件1小时后的α-
半乳糖苷酶活性减少的百分数比在使所述天然α-半乳糖苷酶经受所
述人类血浆条件1小时后的所述天然α-半乳糖苷酶活性减少的百分
数低至少10％；
（c）在使所述多聚蛋白质结构经受人类血浆条件1小时后α-
半乳糖苷酶活性基本上保持不变；
（d）在使所述多聚蛋白质结构经受溶酶体条件1周后α-半乳
糖苷酶活性比在使所述天然α-半乳糖苷酶经受所述溶酶体条件1周
后所述天然α-半乳糖苷酶的活性高至少10％；
（e）在使所述多聚蛋白质结构经受溶酶体条件1天后α-半乳
糖苷酶活性减少的百分数比在使所述天然α-半乳糖苷酶经受所述溶
酶体条件1天后所述天然α-半乳糖苷酶的活性减少的百分数低至少
10％；
（f）在使所述多聚蛋白质结构经受溶酶体条件1天后α-半乳
糖苷酶活性基本上保持不变；
（g）在使所述多聚蛋白质结构经受溶酶体条件后即刻的α-半
乳糖苷酶活性比在使所述蛋白质的所述天然形式经受所述溶酶体条
件后即刻的天然α-半乳糖苷酶的活性高至少10％；
（h）在使所述多聚蛋白质结构经受具有7的pH和37℃的温
度的水溶液后即刻α-半乳糖苷酶活性比在使所述天然α-半乳糖苷酶
经受具有7的pH和37℃的温度的所述水溶液后即刻天然α-半乳糖
苷酶的活性高至少10％；以及
（i）在生理系统中的循环半衰期比所述天然α-半乳糖苷酶的循
环半衰期高至少20％。
2.根据权利要求1所述的多聚蛋白质结构，其中，在使多聚蛋白质结
构经受溶酶体条件1天后，所述多聚蛋白质结构的所述α-半乳糖苷
酶活性基本上保持不变，进一步地在使多聚蛋白质结构经受溶酶体
条件1周后，所述多聚蛋白质结构的所述α-半乳糖苷酶活性基本上
保持不变。
3.根据任何权利要求1至2所述的多聚蛋白质结构，其中，所述连接
部分不存在于天然α-半乳糖苷酶中。
4.一种多聚蛋白质结构，包括通过连接部分彼此共价连接的至少两个
α-半乳糖苷酶单体，其中所述连接部分不在天然α-半乳糖苷酶中存
在。
5.根据权利要求4所述的多聚蛋白质结构，呈现选自由以下组成的组
中的特征：
（a）在使所述多聚蛋白质结构经受人类血浆条件1小时后的α-
半乳糖苷酶活性比在使天然α-半乳糖苷酶经受所述人类血浆条件1
小时后的天然α-半乳糖苷酶的活性高至少10％；
（b）在使所述多聚蛋白质结构经受人类血浆条件1小时后的α-
半乳糖苷酶活性减少的百分数比在使所述天然α-半乳糖苷酶经受所
述人类血浆条件1小时后的所述天然α-半乳糖苷酶活性减少的百分
数低至少10％；
（c）在使所述多聚蛋白质结构经受人类血浆条件1小时后α-
半乳糖苷酶活性基本上保持不变；
（d）在使所述多聚蛋白质结构经受溶酶体条件1周后α-半乳
糖苷酶活性比在使所述天然α-半乳糖苷酶经受所述溶酶体条件1周
后所述天然α-半乳糖苷酶的活性高至少10％；
（e）在使所述多聚蛋白质结构经受溶酶体条件1天后α-半乳
糖苷酶活性减少的百分数比在使所述天然α-半乳糖苷酶经受所述溶
酶体条件1天后所述天然α-半乳糖苷酶的活性减少的百分数低至少
10％；
（f）在使所述多聚蛋白质结构经受溶酶体条件1天后α-半乳
糖苷酶活性基本上保持不变；
（g）在使所述多聚蛋白质结构经受溶酶体条件后即刻α-半乳
糖苷酶活性比在使所述天然α-半乳糖苷酶经受所述溶酶体条件后即
刻天然α-半乳糖苷酶的活性高至少10％；
（h）在使所述多聚蛋白质结构经受具有7的pH和37℃的温
度的水溶液后即刻α-半乳糖苷酶活性比在使所述天然α-半乳糖苷酶
经受具有7的pH和37℃的温度的所述水溶液后即刻天然α-半乳糖
苷酶的活性高至少10％；以及
（i）在生理系统中的循环半衰期高于所述天然α-半乳糖苷酶的
循环半衰期。
6.根据权利要求5所述的多聚蛋白质结构，其中，在使所述多聚蛋白
质结构经受溶酶体条件1天后，所述多聚蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿维多尔·舒尔曼，伊利亚·鲁德费尔，泰里拉·本摩西，塔利亚·谢赫提尔，亚尼瓦·阿聚莱，约瑟夫·沙尔提埃尔，塔利·基日涅尔，
申请(专利权)人：普罗塔里克斯有限公司，
类型：
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